整合素β1反义寡核苷酸治疗胰腺癌的实验研究

论文摘要

胰腺癌是预后极差的人体恶性肿瘤之一。多数病人就诊时已属中晚期，只有20％的病人接受了治愈性根治手术，但5年生存率仍在4％左右。包括化疗在内的综合治疗是提高术后生存率的关键，但现有的化疗药物大多对胰腺癌不敏感。高侵袭性和早期转移是影响胰腺癌预后的主要因素，随着分子生物学研究的深入，以胰腺癌侵袭转移相关基因为靶点的特异性治疗可能会有效提高胰腺癌治愈水平。研究表明，细胞黏附分子（cell adhesion molecules,CAMS）在肿瘤侵袭转移过程中起着极其重要的作用。整合素（integrins）家族是一类重要的细胞黏附分子，由α和β两个亚基组成异二聚体，每个亚基由胞外区、跨膜区与相对较小的含C-末端的胞内区构成，主要介导细胞—细胞外基质（extracellular matrix,ECM）黏附。不同的整合素亚家族由其β亚基所决定，如β1亚基分别与不同的α亚基结合组成整合素β1亚家族。迄今为止，已发现有18种α亚基和9种β亚基共同组成28种具有不同结合专一性的整合素分子。整合素β1亚家族主要与ECM成分如Ⅳ型胶原蛋白、纤黏连蛋白（fibronection,FN）和层黏连蛋白（laminin,LN）等结合。研究发现，在不同的整合素异二聚体中，整合素β1与包括胰腺癌在内的多种肿瘤细胞增殖、分化、黏附、迁移、侵袭和转移密切相关。反义寡核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotides,ASODN）技术是将与靶基因序列互补的小分子寡核苷酸导入细胞，通过激活核酶RNaseH等机制，促使mRNA降解，抑制转录过程，从而抑制编码蛋白的表达。与药物相比，反义寡核苷酸技术有高度的特异性。目前，针对肿瘤恶性表型相关基因设计的ASODN药物已经取得一些研究进展。本研究包括以下几个方面：采用免疫组织化学方法分析胰腺癌组织中整合素β1表达与临床病理特征的关系；将靶向整合素β1的ASODN通过脂质体导入到人胰腺癌BXPC-3细胞中，观察其对整合素β1mRNA和蛋白表达的抑制作用，研究胰腺癌细胞体外侵袭力改变；转染整合素β1 mRNA ASODN后观察细胞生长、凋亡和化疗敏感性的改变；通过建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，进一步观察整合素β1ASODN在体内的抑瘤效果和对靶基因表达的影响。第一部分整合素β1、蛋白激酶Cα在胰腺癌中的表达及其意义目的探讨整合素β1和蛋白激酶Cα（protein kinase C, PKCα）在胰腺癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学S-P方法，检测56例胰腺癌及23例癌旁非肿瘤胰腺组织中整合素β1和PKCα的表达，并分析其与临床病理特征的关系。结果1．整合素β1胰腺癌组织和癌旁非肿瘤胰腺组织中高表达率分别为71.43％和43.48％，两者差异有统计学意义（P＜0.05）；PKCα在胰腺癌组织和癌旁非肿瘤胰腺组织高表达率分别为62.50％和21.74％，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。2．整合素β1高表达与胰腺癌TNM分期（P＜0.05）和淋巴结转移（P＜0.05）有关。3．PKCα高表达与胰腺癌分化程度（P＜0.05）、TNM分期（P＜0.05）和淋巴结转移有关（P＜0.05）。4．在胰腺癌组织中，整合素β1表达与PKCα表达呈正相关（r=0.653，P＜0.05）。结论1．整合素β1和PKCα的表达和／或功能异常可能共同参与胰腺癌的发生发展。2．联合检测两种蛋白对于预测胰腺癌转移潜能具有一定参考价值。第二部分整合素β1反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞体外侵袭力的影响目的观察整合素β1反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响。方法采用脂质体将整合素β1ASODN转染到人胰腺癌BXPC-3细胞中，逆转录聚合酶联反应（reverse transcript-polymerase chain reaction，RT-PCR）、Western印迹法和Transwell侵袭室方法分别检测细胞整合素β1mRNA、蛋白表达水平及体外侵袭能力。结果1．与对照组相比，32mg／L～128mg／L ASODN转染后可抑制整合素β1mRNA和蛋白的表达，其中64 mg／L和128mg／L ASODN对整合素β1mRNA和蛋白的表达有非常显著的抑制作用（P＜0.01）。2．体外侵袭力检测显示，64mg／L整合素β1ASODN转染后使胰腺癌细胞侵袭能力明显下降。结论1．靶向整合素β1的ASODN可有效阻断其在人胰腺癌细胞中的表达。2．靶向整合素β1的ASODN可降低胰腺癌细胞体外侵袭力。第三部分整合素β1反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞生长、凋亡和化疗敏感性的影响目的观察整合素β1反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）对人胰腺癌BXPC-3细胞生长、凋亡和对化疗药物敏感性的影响。方法采用脂质体将整合素β1ASODN转染到人胰腺癌BXPC-3细胞中，MTT法检测细胞相对存活率，Annexin V-FITC／PI染色检测细胞凋亡。以有效转染浓度转染整合素β1ASODN 24小时，给予梯度浓度5—氟尿嘧啶、阿霉素和健择，观察量效关系，计算半数抑制浓度(inhibitory concentration 50％，IC50)。结果1．与对照组相比，32mg／L～128mg／L ASODN转染后可抑制胰腺癌细胞的生长，且呈量效依赖关系，64mg／L和128mg／L抑制作用最明显。2．转染64mg／L整合素β1ASODN 24h，细胞早期凋亡率为20.17±2.04％。3．转染整合素β1ASODN增加胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性，ASODN+化疗组对各化疗药物的IC50均有显著下降。结论1．靶向整合素β1的ASODN可有效抑制胰腺癌细胞生长。2．靶向整合素β1的ASODN可诱导胰腺癌细胞早期凋亡。3．靶向整合素β1的ASODN可增强胰腺癌细胞对化疗药物敏感性。第四部分整合素β1反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用目的观察整合素β1反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）对裸鼠人胰腺癌移植瘤生长和基因表达的抑制作用。方法建立裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤模型，随机分为三组给予不同条件处理：对照组（皮下注射脂质体和转染液），随机序列（random oligodeoxynucleotides，RODN）治疗组（皮下注射RODN、脂质体和转染液），ASODN治疗组（皮下注射ASODN、脂质体和转染液）。治疗期间定期测肿瘤体积和裸鼠体重，计算抑瘤率和肿瘤缩小率。采用RT-PCR和Western印迹法检测治疗后裸鼠肿瘤组织中整合素β1mRNA和蛋白表达情况。结果1．治疗结束后，ASODN治疗组、RODN治疗组和对照组平均肿瘤体积分别为202.82±2.23 mm3、702.34±11.64 mm3和712.98±16.82 mm3，ASODN治疗组与对照组比较差有统计学意义（P＜0.01），而RODN治疗组和对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。ASODN治疗组、RODN治疗组抑瘤率分别为1.49％和71.55％，ASODN治疗组肿瘤缩小15.36％。各组裸鼠体重变化无明显差别。2．与对照组比较，ASODN治疗组裸鼠肿瘤组织中整合素β1mRNA和蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。结论1靶向整合素β1的ASODN可在体内抑制mRNA和蛋白表达。2靶向整合β1的ASODN对人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有一定抑制作用。3整合素β1ASODN成为一种安全有效的抗胰腺癌药物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言及研究背景
• 1、蛋白激酶Ca在胰腺癌中的表达及其意义'>第一部分 整合素β₁、蛋白激酶Ca在胰腺癌中的表达及其意义
• 1反义寡核苷酸对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响'>第二部分 整合素β₁反义寡核苷酸对人胰腺癌BXPC-3细胞体外侵袭力的影响
• 1反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞生长、凋亡和化疗敏感性的影响'>第三部分 整合素β₁反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞生长、凋亡和化疗敏感性的影响
• 1反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用'>第四部分 整合素β₁反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的治疗作用
• 综述
• 整合素和胰腺癌侵袭转移
• 整合素与蛋白激酶C
• 发表论文目录
• 致谢