论文摘要
NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）,即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白编码基因,是1993年Kjeldsen等人在研究中性粒细胞明胶酶（gelatinase B,即matrix metalloproteinase-9,MMP-9）时首先被发现的。随着功能研究的深入,发现NGAL基因与炎症、免疫反应、细胞分化、细胞凋亡、组织重构以及多种肿瘤的发生与发展等密切相关。我们课题组以往研究表明,NGAL基因在胃癌组织细胞中呈现显著异常过表达,荧光素酶报告基因分析显示NGAL基因启动子在胃癌细胞BGC823中具有较强的活性,同时表现明显的TPA反应性,报告基因表达活性比基础状态时的上升3～9倍,表明NGAL基因启动子区存在着TPA反应元件（TPA response element,TRE）,NGAL基因的表达是TPA诱导性的,与以往我们在食管癌组织细胞中的研究结果相一致。另外,结合突变技术研究发现,NGAL基因启动子核心元件位于转录起始位点上游-110/-79区段。同时本课题组以食管癌细胞EC109为研究对象,联合运用寡核苷酸DNA亲和层析,MALDI-TOF-MS等技术,对NGAL基因启动子-107/-82区段的TRE结合蛋白进行了分离纯化,最后确定了C19、KLF10、KLF15和RXRβ等新核蛋白因子。为此,本文拟在以往研究工作基础上,以胃癌细胞BGC823为对象,联合运用分子克隆、双荧光素酶报告基因活性检测、半定量RT-PCR、蛋白质印迹等实验技术,筛选能够与NGAL基因启动子区TRE结合的转录激活因子,确定NGAL是应答TPA等促癌物的一个新靶基因。结果表明,分别转染C/EBPβ、AP-1、C19、KLF10、KLF15、KIAA1949和RXRβ等基因的表达质粒后,报告基因的活性有不同程度的升高,其中转染C/EBPβ的为最高,可达对照组的8.76倍,说明C/EBPβ等均有可能是应答NGAL基因TPA反应性的核蛋白因子;进一步的特异性激酶抑制剂研究发现,MEK→ERK1/2细胞信号转导通路在TPA激活的NGAL基因转录中发挥主要作用。