论文摘要
本研究分别运用DS-ELISA和RT-nPCR方法对上海地区猪、犬和部分野生动物进行了血清学和分子流行病学调查,并对代表株HEV分离株进行全基因组克隆,探明其与已知序列的亲缘关系和变异程度,为跨种间感染与传播机制的研究奠定基础。上海地区HEV主要流行株为基因4型,本研究对上海流行猪HEV代表株的ORF2抗原表位丰富区进行研究,旨在建立用于猪HEV血清流行病学调查的间接ELISA方法,并为HEV疫苗的开发提供依据。本研究主要内容和结果如下:一、上海地区动物HEV抗体的检测为调查HEV抗体在上海地区动物中的分布情况,本研究采用北京万泰生物药业有限公司生产的戊型肝炎病毒抗体（HEV-Ab）酶联免疫诊断试剂盒（DS-ELISA）对采集自上海郊区11个规模猪场的553份1-3月龄、4-6月龄、8-30月龄猪血清样品,198份散养宠物犬血清样品,89份上海野生动物园天鹅、野鸭等珍禽血清样品,50份猴血清,31份猎豹血清抗-HEV抗体进行检测。结果显示,64.56%（357/553）猪、20.7%（41/198）宠物狗、2%（1/50）猴、9.7%（3/31）猎豹、38.2%（34/89）野生珍禽为抗-HEV抗体阳性。1-3月龄、4-6月龄、8-30月龄猪血清抗-HEV抗体阳性率分别为63.4%（168/265）、53.9%（104/193）和89.4%（85/95）。表明HEV抗体在上海地区猪群中广泛流行,HEV抗体在8月龄以上猪群中阳性率最高。在犬、猴、猎豹和野生珍禽中均检测到抗-HEV阳性抗体,提示这些动物都曾经被HEV样病毒感染过,可能作为HEV宿主,在HEV传播中起到重要作用。本研究还首次发现有HEV抗体阳性的猎豹。二、上海地区猪HE分子流行病学调查根据HEV各基因型ORF2的保守序列设计简并引物,建立HEV RNA的逆转录套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测方法。对随机采集自上海9个郊区23个猪场的480份2-4月龄仔猪粪便样品进行HEV RNA检测,并对所有HEV RNA阳性条带进行克隆、测序。然后应用Mega 4.0软件对获得的序列进行系统进化分析,并用DNAstar（version 7.0）计算基因同源率和离散率。结果显示,RT-nPCR检测HEV RNA总阳性率为5%（24/480）,猪场阳性率为26.1%（6/23）。共得到24个348bp的PCR目的序列,系统进化分析表明该24个毒株均为HEV 4型,并可进一步分为4个基因亚型,各亚型间的同源性为83.3%-89.7%,离散率为12.4-19.6。4个亚型分别与AY596311（猪,中国新疆）,AJ344192（人,中国北京）,AB220978（人,日本）和DQ450079（猪,中国新疆）在系统进化上较近,同源性分别为92%、97%、92-97%和97%。说明在上海地区猪场中有4个亚型的HEV 4型流行,且有些基因亚型可能不是上海地区本土株。推测生猪贸易和人类旅游活动对此起着重要的作用。三、猪HEV上海株全基因组克隆及序列分析为进一步研究上海地区猪HEV的代表性毒株,我们对分离到的基因4型代表毒株进行全基因克隆,命名为Sh-Sw-hua。实验共设计17对PCR引物,对Sh-Sw-hua全基因组进行分片段扩增,5’和3’端采用快速扩增方法（RACE）进行扩增。扩增产物进行T/A克隆并测序。全基因组经ClustalX v1.8比对后,使用Mega 4.0进行进化分析,DNAstar（version 7.0）计算基因同源率。结果表明,本分离株除3′UTR polyA之外,基因组全长为7223nt,包括:25nt的5’UTR（1-25）;5109nt的ORF1（26-5134）;2025nt的ORF2（5131-7155）;345nt的ORF3（5159-5503）和68nt的3′UTR（7156-7223）。对该分离株的遗传进化分析表明,该分离株为基因4型。它与上海的另外2个分离株DQ450072、EF570133亲缘关系较近,并在基因4型内部聚成一簇。分别对Sh-Sw-hua全基因组、ORF1、ORF2和ORF3进行同源性分析,结果表明Sh-Sw-hua全基因组和ORF2均与DQ450072同源性最高,分别为89.8%和94.8%;ORF1与EF570133同源性最高为88.1%;ORF3与AB108537同源性最高,为96.8%。提示Sh-Sw-hua和DQ450072、EF570133为上海本土的流行株,它们可能来自同一祖先,说明HEV具有明显的地域性。