论文摘要
目的蚊子唾液中的变应原能够诱发人发生过敏反应。白纹伊蚊（Aedes albopitus）的分布几乎遍布全球,其唾液当中至少含有16种变应原,其变应原种类是同类中最多的。目前,研究证实埃及伊蚊（Aedes aegypti）的三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）是蚊子的最主要交叉变应原,并已经对其重组表达,然而对白纹伊蚊的apyrase蛋白尚未深入研究。本课题扩增白纹伊蚊唾液变应原apyrase蛋白的编码基因,在大肠杆菌中进行表达,获得有生物活性的重组apyrase蛋白,运用杂交瘤技术制备抗apyrase单克隆抗体,将为蚊子引起的过敏性疾病的诊断与治疗奠定基础。方法选取未吸血的白纹伊蚊雌蚊约40只,提取总RNA,采用RT-PCR扩增得到总cDNA;以总cDNA为模板扩增apyrase蛋白编码基因,经测序鉴定后连入载体pET-19b,构建原核表达载体；将载体转入大肠杆菌BL21（DE3） pLysS感受态细胞,以异丙基-p-D-硫代半乳糖苷（Isopropy1β-D-Thiogalactoside, IPTG）诱导表达,利用融合蛋白N端存在的6个组氨酸标签,在变性条件下,通过Ni-NTA柱纯化apyrase蛋白后,以尿素梯度透析的方法且在谷胱甘肽氧化还原体系存在下进行复性。以纯化复性的apyrase蛋白免疫Balb/c小鼠,小鼠产生相应抗体后,将其脾细胞与骨髓瘤细胞进行杂交瘤融合,并通过间接ELISA法进行筛选,有限稀释法进行克隆,获得分泌抗apyrase单抗的特异性细胞株,并对分泌的抗体进行亚型测定。利用斑点印迹试验（Dot blotting）,免疫印迹试验（Western blotting）及间接荧光免疫试验（IFA）检测重组apyrase蛋白和天然apyrase蛋白的一致性。皮肤敏感试验检测重组apyrase蛋白的致敏性。以孔雀石绿显色法和血小板凝集试验检测重组apyrase蛋白的酶活性。结果以白纹伊蚊总cDNA中扩增出的apyrase蛋白编码基因,与GenBank中推测的白纹伊蚊apyrase编码基因序列有96%的同源性；与埃及伊蚊apyrase编码基因序列有83%的同源性。经酶切鉴定及基因测序证实,pET19b-apyrase构建成功。以重组质粒转化BL21（DE3） pLysS菌,以IPTG诱导其表达,进行SDS-PAGE分析,结果显示其分子量约为60kDa。表达蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,经纯化复性后免疫老鼠。杂交瘤融合技术获得了能稳定分泌抗白纹伊蚊apyrase蛋白的杂交瘤细胞株,命名1A1A4,1A1D4,1A1H4,2D9D9,2G11C5,2G11B4,6G8F9均为重链为IgG1型,轻链为κ型。Dot blotting实验显示重组apyrase蛋白和白纹伊蚊唾液腺粗提液均可以与抗重组apyrase蛋白的单克隆抗体1A1H4（Mabs）发生抗原抗体反应,而与正常鼠血清呈阴性反应；Western blotting实验显示唾液腺粗提液中天然apyrase蛋白的条带（60kd）可以与Mabs特异性结合,唾液腺粗提液中其它蛋白条带则与Mabs无反应,而唾液腺粗提液也与正常鼠血清无反应。间接免疫荧光实验显示与Mabs孵育后的冰冻切片唾液腺部位出现亮绿色,为阳性反应,定位天然apyrase蛋白在蚊子唾液腺中的分布。皮肤点刺试验证明重组apyrase能够诱发皮肤发生速发型和迟发型过敏反应。以孔雀石绿显色法测得重组apyrase蛋白水解ATP和ADP的的酶动力学参数Km分别为11.6gM和49.5gM,Vmax分别为1.02nM/S/μg和0.81nM/S/μg蛋白。血小板凝集试验证明以PBS作为空白对照,0.4μM和0.8μM重组apyrase蛋白分别能够抑制6%和9.5%的依赖ADP的血小板凝集。结论成功扩增和克隆白纹伊蚊apyrase蛋白的编码基因,并在大肠杆菌中进行高效表达,制备出了和天然apyrase蛋白有很好一致性的有生物学活性的重组apyrase蛋白,获得了稳定分泌抗白纹伊蚊apyrase蛋白的杂交瘤细胞株,为白纹伊蚊所致的过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。
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相关论文文献
- [1].Apyrase减轻过敏性哮喘小鼠气道炎症及气道重塑[J]. 免疫学杂志 2015(04)
- [2].志贺菌福氏5a M90T毒力蛋白Apyrase的表达、纯化及多克隆抗体制备[J]. 中国免疫学杂志 2013(10)
- [3].生物发光法测定天然水体细菌数量中游离ATP的去除[J]. 应用与环境生物学报 2014(06)