论文摘要
生理妊娠类似于同种异体移植。作为同种移植物的胚胎在母体内存活直至分娩,反映母体对胚胎的免疫耐受；母体对胚胎产生免疫排斥则导致妊娠失败。揭示母-胎免疫耐受的确切机制,将对人类自然流产等妊娠相关疾病的防治具有重要意义,并将对移植免疫学和肿瘤免疫学的研究产生推动作用。母-胎界面主要包括滋养细胞、蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞以及免疫细胞。多年来人们从不同角度研究在母-胎界面发生的生物学事件,以阐述母-胎免疫调节机制。母-胎界面存在大量淋巴细胞,与滋养养细胞紧密接触。由此可见,蜕膜淋巴细胞、蜕膜功能细胞与滋养细胞三者之间必然存在着密切的功能调控,共同参与母-胎免疫调节。蜕膜γδT细胞虽然数量有限,但其功能却不容忽视。我们课题组前期工作以趋化因子和受体为切入点,已经阐明母-胎界面的滋养细胞通过CXCL16/CXCR6这对特异的趋化因子募集γδT细胞到母-胎界面。本研究进一步解析γδT细胞在母-胎界面的调节作用,通过建立人早孕蜕膜γδT细胞和滋养细胞共培养体系,拟阐明蜕膜γδT细胞与滋养细胞之间的相互调节机制。第一部分人早孕期母-胎界面γδT细胞表型目的：分析人早孕期母体内γδT细胞比例变化及表型特征,以及胞内细胞因子的表达。方法：收集正常早孕妇女以及生育年龄正常非孕妇女外周血和蜕膜（内膜）组织,采用流式细胞术分析外周血及蜕膜免疫细胞中γδT细胞的比例；应用免疫磁珠细胞分选技术分离纯化蜕膜γδT细胞,应用流式细胞仪检测蜕膜γδT细胞上CD4和CD8以及胞内6个细胞因子的表达（IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-10, TGF-β1）。结果：正常早孕妇女外周血与蜕膜局部γδT细胞数量比正常未孕妇女均明显增多,并且蜕膜γδT细胞比例明显高于外周血。这些结果提示孕妇体内γδT细胞数量增多与正常妊娠维持有关。分离纯化蜕膜γδT细胞,可获得纯度在95%以上的γδT细胞。蜕膜γδT细胞是CD4-和CD8-双阴性细胞。γδT细胞高水平表达TGF-β和IL-10,低水平表达TNF-α和INF-γ,几乎不表达IL-2和IL-4。结论：蜕膜γδT细胞产生大量调节性细胞因子,在蜕膜局部形成Th2型优势的免疫微环境,从而有利于母-胎耐受的形成。第二部分人早孕期蜕膜γδT细胞对滋养细胞生物学功能的调节作用目的：探讨人早孕期蜕膜γδT细胞对滋养细胞生物学功能的调控作用。方法：收集早孕蜕膜组织,分离蜕膜免疫细胞,磁珠分选获得蜕膜γδT细胞。收集早孕绒毛组织,原代分离培养早孕期滋养细胞。建立γδT细胞和滋养细胞的共培养体系,培养48h后,采用BrdU细胞增殖ELISA检测试剂盒,检测滋养细胞的增殖情况；采用AnnexinⅤ/PI双染试剂盒,流式细胞术分析滋养细胞的凋亡情况；通过建立transwell体系,分析γδT细胞对滋养细胞的侵袭能力的影响。结果：蜕膜γδT细胞诱导滋养细胞增殖和侵袭,而IL-10中和性抗体则明显抑制这一诱导作用,但TGF-β的中和性抗体则无此作用；用重组人IL-10处理滋养细胞,则明显促进滋养细胞增殖和侵袭,而重组人TGF-β则无此作用。蜕膜γδT细胞抑制滋养细胞凋亡,而IL-10中和性抗体则明显拮抗这一抑制作用,但TGF-β中和性抗体则无此作用；用重组人IL-10处理滋养细胞,则明显抑制滋养细胞凋亡,而重组人的TGF-β则无此作用。结论：蜕膜γδT细胞主要通过分泌IL-10促进滋养细胞增殖和侵袭,以及抑制滋养细胞凋亡。因此,γδT细胞可改善滋养细胞的生物学行为,有利于胎盘的形成。第三部分人早孕期滋养细胞对蜕膜γδT细胞生物学功能的调节作用目的：探讨人早孕期滋养细胞对蜕膜γδT细胞的功能调节作用方法：以滋养细胞和γδT细胞共培养体系为基础平台,添加或者不添加CXCL16中和性抗体和人重组CXCL16细胞因子,采用流式细胞术分析滋养细胞及CXCL16/CXCR6对γδT细胞增殖的调节作用,并分析滋养细胞对γδT细胞颗粒酶B表达的调节作用。采用ELISA分析培养上清液中细胞因子TGF-β及IL-10的变化。结果：滋养细胞能够促进γδT细胞的增殖,而CXCL16的中和性抗体则明显抑制这一促进作用；重组人CXCL16单独处理蜕膜γδT细胞也明显促进蜕膜γδT细胞增殖。滋养细胞或人重组CXCL16均可降调节γδT细胞GrB的表达；抗人CXCL16中和性抗体可拮抗γδT细胞降调解GrB表达的作用。滋养细胞促进γδT细胞产生TGF-β和IL-10。结论：人早孕期,滋养细胞通过分泌CXCL16促进蜕膜γδT细胞增殖,并产生TGF-β和IL-10增多,形成一个利于妊娠的良性循环；滋养细胞通过分泌CXCL16下调蜕膜γδT细胞颗粒酶B的水平,降调节γδT细胞对胚胎组织的损伤作用,从而维持正常妊娠。
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