甘草甜素对人工诱导小鼠乳腺炎的免疫保护效应研究

论文摘要

奶牛乳腺炎至今不仅对奶牛业造成严重的经济损失，而且由于治疗过程中抗生素的广泛应用，给人类的健康带来严重的、现实的和潜在的危害。为了进一步认识奶牛乳腺炎发生的免疫病理机制和寻找更理想的防治方法提供基础研究数据，本试验对保定地区5个奶牛场临床型奶牛乳腺炎的病原进行了分离鉴定；并用分离到的金黄色葡萄球菌建立了小鼠实验性乳腺炎模型，观察和分析了乳腺炎模型的局部及整体的临床表现和免疫病理变化；探讨了甘草甜素对小鼠实验性乳腺炎，乳腺局部和整体病理机制及免疫功能的影响。结果表明：将43份临床型乳腺炎奶样进行细菌分离鉴定，生化结果表明共分离到10种91株细菌，以金黄色葡萄球菌（21.98％）、链球菌（19.78％）、大肠杆菌（19.78％）感染为主。小鼠实验性乳腺炎模型，以细菌菌落数（Colony-Forming Units，CFU）为接菌单位，将雌孕鼠分为正常对照组、生理盐水组及1.0×102CFU／50μL、4.0×102CFU／50μL、7.0×102CFU／50μL、1.0×103CFU／50μL、1.0×104CFU／50μL不同浓度金黄色葡萄球菌悬液组，产后8～10d经乳头管注入到小鼠的第4对（腹部）乳腺内，24h观察炎症反应。结果7.0×102CFU／50μL金葡菌组乳腺上皮脱落，腺泡腔内大量炎性细胞浸润，以嗜中性白细胞为主，充血，腺泡内空泡减少，腺泡分泌量减少，间隔增宽，炎症明显。而随着金黄色葡萄球菌用量的加大，乳腺组织的炎症程度加剧。间质宽度、TNF-α及IFN-γ含量与对照组相比极显著升高（P＜0.01），金葡菌在乳腺组织内大量繁殖，CFU急剧增加。小鼠体温升高、临床表现等全身症状以及病理变化真实反映了急性乳腺炎自然发病过程，因此选择7.0×102CFU／50μL金葡菌继续下面的试验。甘草甜素对小鼠实验性乳腺炎的影响，将受孕雌鼠随机分成正常对照组、阳性对照组和试验组。正常对照组于产后8～10d经乳头管注入50μL灭菌生理盐水；阳性对照组和试验组小鼠分别于产后8～10d经乳头管注入50μL7.0×102CFU细菌悬液人工发病。分别于接菌-12h、0h、12h、36h时，正常对照组和阳性对照组腹腔注射灭菌生理盐水0.2mL，试验组分成3个剂量组，将甘草甜素分别配制成2.2 mg／mL、4.4 mg／mL、8.8 mg／mL三个剂量，分别腹腔注射甘草甜素溶液0.2mL。分别于接菌后6h、18h、42h、66h脱颈致死。取乳腺组织固定，进行组织病理学观察及间质宽度的测定，甲苯胺蓝染色观察乳腺肥大细胞的变化，取乳腺匀浆液，用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测TNF-α及IFN-γ含量变化。结果甘草甜素各组小鼠精神状态良好、体温平稳，能够抑制金葡菌在乳腺组织内繁殖，显著降低CFU（P＜0.01），因而减少了对乳腺组织的刺激，病理变化减轻，间质宽度缩小，充血减轻。甘草甜素不同剂量组肥大细胞数在感染6～42h与生理盐水组、阳性对照组相比无统计学差异（P＞0.05），且组间无差异性（P＞0.05），但甘草甜素组脱颗粒肥大细胞少于阳性对照组，数据表明甘草甜素能够很好地抑制肥大细胞脱颗粒。ELISA试验结果显示甘草甜素显著降低乳腺内TNF-α和IFN-γ的浓度，且呈剂量依赖性，但高于正常对照组。甘草甜素调节乳腺内TNF-α和IFN-γ水平在一定范围内，即参与机体免疫反应又控制组织的过度炎症。结论：保定地区5个奶牛场临床型乳腺炎其病原体以金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌感染为主；用金黄色葡萄球菌建立的小鼠实验性乳腺炎模型其局部等症状和病理机制与自然感染的乳腺炎炎症病理过程类同，可以用做乳腺炎的免疫病理学和筛选有效药物使用；甘草甜素对小鼠实验性乳腺炎有一定的保护和免疫调节作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 主要试剂及药品
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 试验动物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细菌的分离与鉴定
• 2.2.2 小鼠乳腺炎的人工诱导
• 2.2.3 甘草甜素对金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎的影响
• 2.2.4 H.E染色法观察乳腺组织病理变化及间质宽度的测定
• 2.2.5 甲苯胺蓝染色检测乳腺内肥大细胞
• 2.2.6 ELISA测定乳腺组织中TNF-α的含量
• 2.2.7 ELISA测定乳腺组织中IFN-γ的含量
• 2.3 统计处理
• 3 结果
• 3.1 临床型乳腺炎乳样特征及细菌分离、鉴定结果
• 3.1.1 临床型乳腺炎乳样特征
• 3.1.2 细菌分离鉴定结果
• 3.2 金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎模型的建立
• 3.2.1 临床症状
• 3.2.2 体温变化
• 3.2.3 乳腺病理变化及组织学观察
• 3.2.4 乳腺组织间质宽度变化
• 3.2.5 肥大细胞的分布和数量变化
• 3.2.6 乳腺组织中CFU、TNF-α及INF-γ的变化
• 3.3 甘草甜素对金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎的影响
• 3.3.1 临床症状
• 3.3.2 体温变化
• 3.3.3 乳腺组织中细菌落数目的变化
• 3.3.4 乳腺病理变化及组织学观察
• 3.3.5 间质宽度的变化
• 3.3.6 肥大细胞的分布和数量变化
• 3.3.7 脾指数、胸腺指数的变化
• 3.3.8 乳腺组织中TNF-α含量
• 3.3.9 乳腺组织中INF-γ含量
• 4 讨论
• 4.1 奶牛乳腺炎病原特点
• 4.2 临床型乳腺炎发展趋势
• 4.3 小鼠实验性乳腺炎模型的建立
• 4.3.1 试验动物的选择
• 4.3.2 诱导物的选择
• 4.3.3 小鼠发生实验性乳腺炎时全身反应、乳腺组织和主要炎症指标的变化
• 4.4 甘草甜素对金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎的影响
• 4.4.1 甘草甜素的药理作用
• 4.4.2 甘草甜素对金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 附图及说明
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢
• 附录