Galanin在神经细胞发育过程中的作用研究

论文摘要

Galanin（甘丙肽,Gal）,是一种在哺乳动物脑中有广泛分布的神经肽,它通过几种galanin受体亚型介导参与了体内广泛的生理过程和病理反应。以前对galanin和galanin受体系统在神经系统相关研究主要通过原位杂交和galanin受体结合放射自显影在大鼠上进行。有结果表明,galanin和galanin受体mRNA表达在发育中的和成熟的大鼠脑内神经细胞新生部位包括脑室下带（SVZ）,海马的齿状回（DG）和吻端迁移途径（RMS）都有发现。在功能上,galanin除了在成体脑中起快速传导的调制作用外,越来越多的线索表明,galanin在神经生成和神经损伤修复中能起到营养因子的作用。最近,有发表的研究结果描绘了galanin mRNA和galanin免疫阳性细胞体及纤维在小鼠脑中的分布。但是对于galanin受体在正常小鼠脑中的分布的相关信息还是较为有限的。在本研究的第一部分工作中,首先我们通过[125I]-galanin结合受体放射自显影检测了galanin受体在C57BL/6J小鼠的分布。结果发现,[125I]-galanin结合信号遍及脑的各部分,包括基底神经节,边缘结构（系统）,内外侧丘脑核,下丘脑的视前和外侧区,中脑,脑桥,延髓和小脑皮质。而在嗅球,新皮层,背侧海马等部位只有很低的甚至没有结合信号。对galanin受体的分布的研究结果表明小鼠和大鼠之间存在很大的相似之处,同时也有一些局部差异,这对将来进行中枢galanin传导的对比研究提供了有价值的参考。其次,我们对小鼠脑内galanin的表达分布进行了免疫组织化学检测。结果与已发表的galanin mRNA的分布研究成果基本符合。在这些组织解剖学上的研究证明了galanin及其受体在小鼠脑内的SVZ,RMS and DG等部位的存在,这与来自大鼠的相关结果相一致。然后,我们利用原位杂交在出生后不同天数的小鼠上检测了galanin,GalR1和GalR2在这些部位的表达情况。我们发现第1天或第4天时已经可以在DG和RMS处发现galanin和两种受体的表达,并随出生后时间逐渐增强。SVZ处的信号则出现在10天之后。在成年小鼠中,这3个部位始终存在galanin及2种受体的表达。这些发现表明galanin可能在正常或病理状况下的成鼠脑中参与了调节神经发生的过程。本研究的第二部分工作运用体外原代培养的神经干细胞（NSC）验证galanin及其受体在神经分化过程中的作用。近来,galanin及其受体的表达在小鼠胚胎干细胞中的发现暗示了galanin在干细胞生理中可能具有调节作用。然而,我们对于galanin及受体如何参与神经干细胞或前体细胞的发育和分化方面依然知之甚少。由此,我们建立了分别来自野生型和GalKO小鼠SVZ的NSCs原代培养。值得注意的是,GalKO NSCs在分化3天后产生的神经突长度显著短于同样条件下的野生型NSCs。而在RT-PCR实验中,除了GalKONSCs中缺乏galanin外,galanin和3种受体的表达在NSCs中都被检测到。为了检测galanin对NSCs在分化过程中的神经突生长的作用,我们利用galanin,GalR2/3的受体激动剂-Gal（2-11）和galanin受体拮抗剂-M35进行细胞实验。结果发现,外源的galanin and GAL（2-11）作用于分化培养中的两种NSCs 4h后,产生胞突的细胞比例显著地提高,并且在培养48h和72h后βⅢ-tubulin阳性细胞的神经突长度都比对照有明显增加。而这种作用能被M35的处理所减弱。第三部分工作对galanin在该过程中的信号途径进行了初步的探讨。在PC12细胞和背根神经节细胞上的研究发现,galanin能够改变细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）的活性,而这种作用是通过GalR2的激活介导的。为了进一步了解在促神经突生长过程中的galanin受体的参与机制,我们也从GalR1KO小鼠获得并建立了NSCs的培养,并且在分化培养的NSCs中利用ERK、PKC和PKA的阻断剂进行实验检测。结果发现,galanin和Gal（2-11）能够增加野生型和GalR1KO NSCs的ERK磷酸化水平,而ERK和PKC的阻断剂的使用能减弱这种作用。同时,细胞形态学上也表现出同样作用。相反,PKA抑制剂的添加则对神经突的伸长生长和ERK的磷酸化没有明显作用。我们还对galanin,Gal（2-11）和M35分化处理后的野生型和GalR1KO NSCs的galanin受体表达进行了Real-timePCR检测。结果表明,GalR2的mRNA表达在发育的神经干细胞中远高于GalR1和GalR3,而galanin或Gal（2-11）处理明显上调了GalR2的表达。这些结果都表明galanin能够促进神经突在分化的神经干细胞的神经突生长,这种过程是通过GalR2介导并进一步激活PKC-ERK信号系统。结论:1.来自[125I]-galanin结合受体放射自显影,免疫组织化学和原位杂交的结果表明galanin及其受体的多肽或mRNA在成年和早期发育的小鼠脑内的SVZ、DG和RMS等部位均有的表达;2.来自wild-type小鼠的NSCs表达galanin及其受体。Galanin和受体激动剂Gal（2-11）有促进NSCs分化中神经突的生长作用;3.药理学实验结果发现,Galanin促进分化的NSCs神经突生长的作用主要是通过GalR2介导激活ERK-MAPK途径实现的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 综述 关于galanin
• 引言
• 一.Galanin的基因表达调节
• 二.Galanin在中枢神经系统中的表达
• 三.Galanin受体
• 四.Galanin的主要生理功能
• 五.Galanin和神经损伤
• 第二部分 小鼠脑内的galanin及其受体的表达分布
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 C57BL/6J小鼠和galanin KO小鼠神经干细胞的原代培养的建立及细胞发育中的特点比较
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 Galanin对神经干细胞分化的作用研究
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 致谢