兔膀胱移行细胞原代培养及其与丝素膜相容性的研究

论文摘要

组织工程是一门新兴的综合性学科,它应用细胞生物学和工程学的原理,研究和开发修复损伤组织和改善其功能的替代物。通过少量组织细胞体外培养扩增达到一定数量后,接种到具有一定空间结构的支架上,构成有生命活力的细胞支架复合物,移植到体内以达到修复或替代组织损伤的目的。组织工程是人类治疗组织、器官功能衰退和缺失的研究方向。近十几年来,泌尿系统组织工程有了迅速的进展。国外学者已经开始研究组织工程化膀胱、输尿管与尿道,并在实验动物体内进行相应器官的替代。由于正常膀胱上皮细胞体内生长微环境复杂、不容易在体外复制,使得种子细胞的大量扩增成为困扰国内众多研究者的一大难题。研究背景泌尿系统器官由于先天性异常或后天性损害导致的畸形或缺损（例如:尿道下裂、泄殖腔外翻、神经原性膀胱、间质性膀胱炎和膀胱癌等）需要进行重建或修复,尽可能恢复受损器官的结构和功能。以膀胱为例,过去有很多种方法对容量小和低顺应性膀胱进行修复,例如应用大肠、小肠以及胃对病理性膀胱进行修复,但这些方法存在许多并发症,如慢性感染、高氯性代谢性酸中毒、黏液分泌过多、形成结石、磷酸钙的代谢异常、胃肠功能的紊乱以及膀胱成型术后仍然有膀胱穿孔和膀胱癌复发的可能。产生这些并发症的原因就在于:①膀胱与胃肠道的上皮组织功能的不同;②胃肠道黏膜接触面发生了改变。目前有很多种修复方法都是为克服这些并发症的发生,其中包括带蒂组织移植物修复和游离组织移植物修复,游离组织移植物包括皮肤、筋膜、腹膜、心包膜、小肠黏膜下层和脱细胞基质。利用这些移植物修复膀胱的原理是认为膀胱移行上皮细胞有再生功能,这些移植物能作为一个三维支架,膀胱移行上皮细胞在支架上生长,最终形成正常膀胱组织。另外还有很多人工合成可降解生物支架:聚乳酸、聚羟基乙酸和聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚物。不幸的是单纯用这些移植物修复膀胱的效果并不好,于是在此基础上构思出一种新的方法修复缺损膀胱,就是将自体膀胱移行上皮细胞和平滑肌细胞在体外扩增再种植到支架上形成细胞支架复合物,最后将细胞支架复合物移植到体内完成缺损膀胱的修复。所以随着细胞生物学、组织材料科学和工程学的不断发展,在不久的将来泌尿系器官缺损的修复将会取得关键性的突破。研究目的1.目前组织工程技术中分种植细胞技术和不种植细胞技术两种,其中种植细胞技术是指通过活检取得宿主的原代细胞,经过体外扩增,再将其种植到可降解的生物膜上,一段时间体外培养后,移植回宿主体内,最终形成有功能的组织;而不种植细胞技术是指直接将生物可降解材料植入宿主组织缺损部位,通过宿主自身的再生能力达到组织再生的目的。但有研究表明不种植细胞技术在膀胱修复重建中只是短期效果好,而长期效果不理想。随着时间的推移不种植细胞修复重建的膀胱表现出的不足有:膀胱逼尿肌的再生非常有限,大量胶原组织沉积导致瘢痕纤维化,最终导致膀胱容量减小以及顺应性降低。所以自体细胞移植也就是种植细胞技术很有可能在泌尿系组织的修复重建方面取得重大突破。我们实验研究第一部分的目的在于建立用于膀胱组织工程研究的移行上皮细胞体外扩增的方法。2.组织工程研究中细胞支架是另一个重要因素。理想的细胞支架应该具备良好的细胞相容性、降解性以及适合组织的结构和功能特性。本实验所延玫南赴Ъ苁撬克氐鞍啄ぁＫ克氐鞍资谴硬纤恐刑崛〉奶烊幌宋鞍?具有良好的物理化学性能和生物相容性,因而应用于生物医学领域中的软组织相容性材料制作有着广阔的前景。丝素蛋白已经应用于手术缝合线、隐形眼镜、人工血管、创面覆盖物、硬脑膜修补材料、细胞培养基质方面。所以实验第二部分目的主要是检测丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞的细胞相容性,探讨构建泌尿系腔道组织工程器官的可能性。研究方法1.兔膀胱移行上皮细胞的体外培养方法手术获取兔膀胱移行上皮组织,以胶原酶与胰蛋白酶相结合的方法获取膀胱移行上皮细胞,用含有血清,表皮生长因子的DMEM/F12培养液进行培养,接种时细胞的密度为2×105/ml,当细胞达70%～80%融合时用胰蛋白酶和二胺四乙酸消化细胞并进行传代。细胞在37℃、5%CO2孵箱内静置培养。培养过程中观察细胞形态变化及生长、增殖过程。最后对培养的细胞进行细胞免疫荧光检测。2.兔膀胱移行上皮细胞与丝素蛋白膜相容性的研究利用MTT比色法检测丝素蛋白膜对兔膀胱移行上皮细胞的细胞毒性。分别设立空白组（无细胞）、阴性对照组（培养基）和实验组（丝素蛋白膜浸提液）。取对数生长期的膀胱移行上皮细胞,1×104/ml接种于96孔板中,每组各5孔,于接种后24、72和120小时,通过MTT法显色,并于酶标仪490 nm波长下检测吸光度OD值,计算相对增殖率,对丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞的相容性进行评估。统计方法:应用SPSS11.5统计软件,第24、72和120小时三个时间分别两组间比较采用两独立样本t检验（α=0.05）。研究结果1.兔膀胱移行上皮细胞的体外培养含10%血清及10μg/L表皮生长因子DMEM/F12体系适合膀胱移行上皮细胞生长。细胞接种后3天,可见上皮细胞生长,7～8天可传代,可传至7～8代。经细胞免疫荧光检测证实,培养的细胞为兔膀胱移行上皮细胞。细胞冻存后复苏,其形态与生命力维持正常。由以上结果可见,DMEM/F12体系能很好地对膀胱移行上皮细胞进行体外培养,并使其增殖。2.兔膀胱移行上皮细胞与丝素蛋白膜相容性第24、72和120小时实验组吸光度值分别为0.424±0.020、0.996土0.118和1.285±0.048,阴性对照吸光度值分别为0.419±0.030、1.105±0.098和1.228±0.052,与阴性对照组比较无明显差异（P＞0.05）。膀胱移行上皮细胞在实验组第24、72和120小时平均相对增殖率（relative growth rate,RGR）98.66%,评分丝素蛋白膜总的细胞毒性为0级;根据该实验数据绘制细胞生长曲线可看出实验组和对照组两条生长曲线几乎平行,说明实验组和对照组对细胞生长的影响无明显差别。研究结论1.此培养方法能在短时间内获得大量移行上皮细胞,为进一步采用组织工程技术构建尿道提供种子细胞,为治疗重度尿道下裂、神经原性膀胱、间质性膀胱炎和膀胱癌等顽症提供依据。2.丝素蛋白膜与膀胱移行上皮细胞相容性良好,具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 兔膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定
• 实验材料和仪器
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 兔膀胱移行上皮细胞与丝素蛋白膜相容性的研究
• 材料和仪器
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 附图
• 中英文缩写词表
• 统计学合格证明
• 在读期间发表的论文
• 致谢