重组人单链IL-23的构建、表达及生物学活性的鉴定

论文摘要

目的：（1）构建重组人单链IL-23（hscIL-23）融合基因及pMD18-T-hscIL-23质粒；（2）构建原核表达质粒pET-28a（+）-hscIL-23和真核表达质粒pcDNA3.1（+）-hscIL-23；（3）原核表达hscIL-23重组蛋白；（4）真核表达hscIL-23重组蛋白；（5）初步鉴定真核表达的hscIL-23的生物学活性。方法：（1）设计引物，应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头（linker）（Gly4Ser）3串联扩增自本实验室前期构建的pMD18-T-p40质粒和pMD18-T-p19质粒的IL-23p40和p19亚基基因，使p40亚基基因在前，p19亚基基因在后，即p40+linker+p19（简写为hscIL-23）。将hscIL-23融合基因插入至pMD18-T载体中，经基因测序验证融合基因是否正确。（2）提取pMD18-T-hscIL-23质粒DNA，经HindⅢ和Nhe I双酶切，纯化后的酶切产物hscIL-23基因通过T4连接酶与经Hind Ⅲ, Nhe I双酶切并纯化的pET-28a（+）原核表达质粒连接，构建原核表达质粒pET-28a（+）-hscIL-23，采用同样的方法构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-hscIL-23。（3）将原核表达质粒pET-28a（+）-hscIL-23转化至大肠埃希菌BL21（DE3+）中，IPTG诱导表达带有His标签的重组蛋白，采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白，采用SDS-PAGE电泳和Western blot分析鉴定表达产物。（4） pcDNA3.1（+）-hscIL-23质粒按不同比例通过阳离子聚合物介导转染HeLa细胞，同时设转染pcDNA3.1（+）质粒组和未转染质粒组，转染48h后分别收集细胞及细胞培养上清。以人IL-23ELISA试剂盒鉴定各组细胞培养上清中hscIL-23融合蛋白的含量，通过与标准品比对，测定各组细胞培养上清中hscIL-23的表达水平。（5）分离人PBMCs，加入收集的各组细胞培养上清及PHA-P共培养72h，MTT法检测各组人淋巴细胞的增殖水平。结果：（1）构建的pMD18T-hscIL-23质粒经测序鉴定，插入片段序列序列与预期完全一致。构建的pcDNA3.1（+）hscIL-23和pET-28a（+）-hscIL-23表达质粒，其基因测序结果同样无改变，p40、p19、linker的连接顺序、方向及序列均与预期相符。（2）原核表达质粒pET-28a（+）-hscIL-23转化的大肠杆菌可成功表达重组蛋白。经SDS-PAGE和Western blot鉴定，所表达重组融合蛋白（hscIL-23）约为60kd，且能为hscIL-23p19抗体所识别。（3）转染各组质粒的HeLa细胞中， ELISA检测HeLa细胞在转染质粒48h后培养上清液中hscIL-23蛋白的含量，其中未转染组细胞培养上清为9.11±11.78pg/ml，转染pcDNA3.1（+）组的含量为10.47±9.04pg/ml，而转染pcDNA3.1（+）-pscIL-12组为254.34±2.77pg/ml，显著高于前两组（P<0.01）。（4）通过MTT法检测各组细胞培养上清刺激人淋巴细胞的增殖结果，未转染质粒组在570nm处的吸光度为0.553±0.038，PHA-P刺激组（阳性对照组）为1.968±0.018，转染pcDNA3.1（+）组为0.595±0.289，转染pcDNA3.1（+）-hscIL-23组组为1.135±0.048，显著高于未转染质粒组和转染pcDNA3.1（+）组（P<0.01）。结论：（1）成功构建了原核表达质粒pET-28a（+）-hscIL-23和真核表达质粒pcDNA3.1（+）-hscIL-23；（2） pET-28a（+）-hscIL-23重组质粒在大肠杆菌内表达出目的蛋白；（3） pcDNA3.1（+）-hscIL-23在HeLa细胞中成功表达hscIL-23融合蛋白；（4）含真核表达hscIL-23蛋白的细胞培养上清能够刺激人淋巴细胞增殖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 英中文术语缩略语对照表
• 附录 B 常用试剂配制
• 附录 C 个人简历及发表论文
• 附录 D 综述
• 参考文献