猪脂肪沉积候选基因PTP-1B和AQP7的分离和初步研究

论文摘要

本研究根据国内外QTL报道、猪—人比较图谱和基因的生理生化功能三方面信息选取两个基因PTP-1B和AQP7作为猪脂肪沉积候选基因，利用比较基因组学和生物信息学方法对两个基因序列进行分离和测序，分析了候选基因的多态性位点与猪重要经济性状尤其是脂肪沉积性状的相关性及其遗传效应，以及使用Real-time PCR方法研究了PTP-1B和AQP7两个基因在猪不同组织中的表达。获得的主要结论如下：一猪PTP-1B基因的分离、测序和性状关联分析以人PTP-1B基因序列作为探针，在NCBI的EST数据库中比对得到猪EST序列并进行拼接。根据拼接序列设计引物扩增出了部分5’端非编码区序列、全部编码区序列和部分3’端非编码区序列。通过外显子设计引物扩增出了6、7、8、9内含子序列。内含子剪接位点序列符合GT／AG法则。用ClustalW工具比对大白、长白和梅山序列发现其编码区很保守没有任何突变，在内含子中发现有14处SNPs，在3’端有3处SNPs。取第7内含子一导致Eco88Ⅰ酶切位点进行与脂肪沉积性状关联性分析，建立了该突变位点的PCR—Eco88Ⅰ—RFLP分型方法，在梅山、大白和“大白×梅山”F2代资源家系中的研究表明：1．在21头长白、16头大白和22头梅山个体中，大白和长白只有单一的G等位基因，而中国本地猪种梅山以杂合子GA基因型为主，因此西方猪种和中国本地猪种此位点有一定差异。2．本研究213头“大白×梅山”F2代资源家系用于性状关联分析。在此位点，AA、AG和GG基因型数目分别为133、69和11个。PTP-1B基因多态性与板油重、内脂率呈极显著相关（P＜0.01），与胸腰椎间背膘厚呈显著相关（P＜0.05）。且杂合子AG基因型个体的板油重和内酯率都呈最低，胸腰椎间背膘厚GG基因型最低。二猪AQP7基因的分离、测序和性状关联分析以人AQP7基因序列作为探针，在NCBⅠ的EST数据库中得到一段猪cDNA文库中的序列，根据此序列设计引物扩增出猪AQP7基因部分cDNA序列，并以此cDNA序列设计引物扩增出猪AQP7基因1、4、5、6内含子，在内含子1中发现有4处SNPs，内含子4中发现2个SNPs，其一位点导致PstⅠ酶切。以第4内含子（A-G）多态位点建立该位点的PCR-PstⅠ-RFLP分型方法，在梅山、大白和“大白×梅山”F2代资源家系中的研究表明：1．在24头梅山、21头大白和18头长白个体中，大白和长白以GG基因型为主，伴随少量的AG型，其中大白G％97.60％，A％为2.40％，长白G％为91.65％，A％为8.35％，而梅山G％33.35％，A％为66.65％，由此可以看出在本研究群体中，等位基因A，B在以梅山和大白、长白为代表的中外猪种中存在明显差异。2．用234头“大白×梅山”F2代资源家系进行性状关联分析，结果表明该位点与猪板油重、内脂率、背膘厚、肥肉率和瘦肥比率等脂肪沉积性状显著相关，且GG基因型个体脂肪沉积性状值比AA基因型个体低，提高G等位基因频率可显著减少脂肪沉积。根据REG（SAS8.0）程序分析，该位点以加性遗传效应为主，花油重、6—7腰椎间背膘厚、肥肉率加性效应极显著（P＜0.01）。三Real-time PCR利用Real-time PCR技术分析了PTP-1B和AQP7基因在4月龄大白猪的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、卵巢、脂肪几种组织中的表达情况。分析结果发现：PTP-1B基因在所检测的8种组织中广泛表达，在肺中表达量最高，其次是小肠和脂肪，表达量最低的是心脏和肾脏；AQP7基因在肝脏中表达量最高，其次是心脏，在卵巢和脂肪中微量表达，在脾和胃中几乎不表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 资源家系测定性状的英文缩写
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 动物脂肪代谢机制
• 2.1 脂肪细胞的形成及脂肪合成途径
• 2.1.1 脂肪细胞的分化
• 2.1.2 脂肪细胞分化的分子机制
• 2.1.3 分化转录因子对脂肪细胞分化的影响
• 2.1.4 其他对脂肪细胞分化可能有影响的基因
• 2.1.5 脂肪合成的分子机制
• 2.2 脂肪降解途径
• 2.3 脂肪组织的其他功能
• 3 拟分离基因的研究现状
• 3.1 PTP-1B（protein tyrosine phosphatese 1B）
• 3.2 AQP7（Aquaporin 7）
• 4 本研究所使用的分子标记PCR-RFLP方法研究进展
• 4.1 RFLP分子标记的介绍
• 4.1.1 PCR-RFLP基本原理及优缺点
• 4.1.2 几种改进的RFLP方法
• 4.2 PCR-RFLP在猪育种中的应用及展望
• 5 Real-time quantitative PCR
• 5.1 实时荧光定量PCR技术原理
• 5.2 两个重要概念
• 5.3 应用
• 6 研究目的与意义
• 第二章 材料与试验方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物DNA样品
• 1.2 试验动物组织样品
• 1.3 主要仪器和设备
• 1.4 主要药品及试剂
• 1.5 缓冲液和常用试剂的配置
• 2 试验方法
• 2.1 猪基因组DNA的提取
• 2.2 基因组DNA浓度的测定和质量检测
• 2.3 猪脂肪沉积候选基因PTP-1B和AQP7基因cDNA序列的克隆、测序
• 2.3.1 引物设计及合成
• 2.3.2 猪各组织RNA的提取及cDNA第一链的合成
• 2.3.2.1 总RNA的提取
• 2.3.2.2 RNA完整性的检测
• 2.3.2.3 cDNA第一链的合成
• 2.3.3 RT-PCR方法扩增cDNA
• 2.3.3.1 RT-PCR反应
• 2.3.3.2 RT-PCR反应产物的检测
• 2.3.4 PCR产物回收、可隆、测序和生物信息学分析
• 2.3.4.1 PCR产物的回收
• 2.3.4.2 载体连接
• 2.3.4.3 感受态细胞的制备（CaC12法制备感受态）
• 2.3.4.4 连接产物的转化
• 2.3.4.5 阳性克隆子的鉴定及测序
• 2.3.5 生物信息学分析及相应软件
• 2.4 猪脂肪沉积候选基因PTP-1B和AQP7基因组序列的克隆、测序
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 PCR反应体系及条件
• 2.4.3 基因多态性扫描和遗传方式分析
• 2.4.4 多态性与性状的关联统计分析
• 2.5 基因的组织表达研究
• 3 结果与分析
• 3.1 猪PTP-1B基因cDNA及部分基因组分离和克隆测序结果
• 3.1.1 猪PTP-1B基因cDNA序列的克隆、测序
• 3.1.1.1 RT-PCR扩增结果
• 3.1.1.2 PTP-1B部分基因组PCR结果
• 3.1.1.3 大白、长白和梅山三个猪种基因组PCR产物克隆测序结果
• 3.1.1.4 PTP-1B基因大白、长白和梅山三个猪种cDNA克隆和测序分析
• 3.2 猪AQP7基因部分cDNA及部分基因组分离和克隆测序结果
• 3.2.1 猪AQP7基因部分cDNAPCR扩增结果
• 3.2.2 AQP7部分基因组PCR扩增结果
• 3.2.3 AQP7基因大白、长白和梅山三个猪种cDNA克隆和测序分析
• 3.2.4 AQP7基因不同品种猪基因组序列测序结果分析
• 3.3 猪PTP-1B和AQP7基因多态性与猪脂肪沉积性状关联分析结果
• 3.3.1 PTP-1B基因多态性与猪脂肪沉积性状关联分析结果
• 3.3.1.1 PTP-1B基因酶切
• 3.1.1.2 PCR—RFLP结果及基因型和等位基因频率
• 3.1.1.3 猪PTP-1B基因PCR-Eco88I-RFLP基因型与性状的关联分析
• 3.3.2 AQP7基因多态性与猪脂肪沉积性状关联分析结果
• 3.3.2.1 AQP7基因酶切结果
• 3.3.2.2 PCR—RFLP结果及基因型和等位基因频率
• 3.3.2.3 猪AQP7基因PCR-PstI-RFLP基因型与性状的关联分析
• 3.4 SYBR green Real-time PCR结果
• 3.4.1 PTP-1B基因的表达
• 3.4.2 AQP7基因的表达
• 4 讨论
• 4.1 关于基因的SNPs检测及多态性与性状的关联分析
• 4.1.1 基因SNPs的检测
• 4.1.2 性状关联分析
• 4.1.2.1 AQP7基因第4内含子的多态性
• 4.1.2.2 PTP-1B基因第7内含子的多态性
• 4.2 关于使用降落PCR（touchdown PCR,TD-PCR）扩增目的序列
• 4.3 关于Real-time PCR
• 5 小结
• 6 下一步工作
• 参考文献
• 致谢