转录因子Mtf1和分子伴侣Hsp60相互作用对裂殖酵母线粒体基因转录的研究

论文摘要

裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）线粒体转录因子（Mitochondrial transcription factor 1） Mtfl是线粒体基因转录的重要部分,由细胞核基因编码并在胞质内组装,最后进入线粒体。作为线粒体内的转录因子,Mtfl通过与RNA聚合酶和转录基因复合物相互结合,调控线粒体基因的转录。转录因子Mtf1怎样从细胞核经过一系列的修饰、折叠并转运进入线粒体中发挥作用,目前还不清楚。我们通过体内串联亲和纯化实验结合质谱分析,发现分子伴侣Hsp60能和Mtf1相互作用。利用大肠杆菌体外表达系统,将二者体外表达,通过体外GST-pull down实验进一步证明二者确实存在相互作用。同时,我们通过表面等离子共振实验,获得二者相互结合的动力学参数和亲和力平衡常数。ETB是人Hsp60蛋白的特异性抑制剂,我们通过体外实验证明,加入ETB后,能破坏Hsp60和Mtf1的相互作用。同时发现,加入ETB处理裂殖酵母野生型972细胞,能够明显抑制细胞生长,而且通过基因转录水平的检测发现,ETB不影响裂殖酵母体内DNA的水平,但能明显抑制线粒体内RNA的转录水平。通过以上实验结果表明,ETB能够抑制裂殖酵母中Hsp60的活性,破坏Hsp60和Mtf1的相互作用,进而影响线粒体转录因子Mtf1从细胞核到线粒体的转运,从而影响线粒体内基因的转录水平。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 线粒体基因转录
• 1.1 线粒体功能和研究意义
• 1.2 线粒体基因转录研究进展
• 1.3 裂殖酵母线粒体基因转录研究进展
• 2 分子伴侣Hsp60与线粒体基因转录
• 2.1 Hsp60功能和研究意义
• 2.2 Hsp60和线粒体转录因子Mtf1相互作用研究进展
• 3 ETB介绍
• 4 本文研究意义
• 第二章 分子伴侣Hsp60与线粒体转录因子Mtf1体内相互作用
• 1 材料和仪器
• 1.1 质粒
• 1.2 引物序列
• 1.3 培养基
• 1.4 酵母转化实验试剂
• 1.5 串联亲和纯化（TAP）实验试剂
• 1.6 SDS-PAGE相关试剂
• 1.7 仪器
• 2 方法
• 2.1 菌株的构建
• 2.2 串联亲和纯化（TAP）
• 2.3 蛋白质的检测与验证
• 2.4 质谱检测
• 3 结果
• 3.1 TAP实验结果与分析
• 3.2 MALDI-TOF MS实验结果与分析
• 4 讨论
• 第三章 分子伴侣Hsp60与线粒体转录因子Mtf1体外相互作用
• 1. 材料和仪器
• 1.1 质粒
• 1.2 引物序列
• 1.3 培养基
• 1.4 其它试剂
• 1.5 仪器
• 2. 方法
• 2.1 质粒的构建
• 2.2 重组蛋白的表达纯化
• 2.3 GST-pull down实验
• 2.4 表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）
• 3. 结果
• 3.1 体外GST-pull down实验结果与分析
• 3.2 表面等离子共振（SPR）实验结果与分析
• 4 讨论
• 第四章 ETB体外抑制实验
• 1. 材料和仪器
• 1.1 Real-Time PCR引物序列
• 1.2 培养基
• 1.3 其它试剂
• 1.4 仪器
• 2. 方法
• 2.1 GST-pull down实验
• 2.3 裂殖酵母基因组DNA抽提
• 2.4 裂殖酵母总RNA的抽提
• 2.5 cDNA的合成
• 2.6 实时荧光定量PCR实验
• 3 结果
• 3.1 ETB体外抑制实验结果和分析
• 3.2 ETB对裂殖酵母细胞生长的影响
• 3.3 ETB抑制线粒体基因的转录
• 4 讨论
• 第五章 展望
• 致谢
• 参考文献