论文摘要
本论文采用RT-PCR法,从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因LhcaPe01 （GenBank EU035496）;LhcaPe02（GenBank EU121593）; LhcaPe03 （GenBank EU366147）; LhcaPe04（GenBank EU366146）的全长。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及蛋白结构进行预测。为了解析毛竹PSI四条基因的功能,对毛竹进行了不同光照强度的处理,根据荧光参数的变化判断胁迫程度采集叶片,进行荧光实时定量PCR,选用GAPDH和β-actin作为内参基因,正常光照的叶片作为对照,采用最大二阶导数（2-ΔΔCt）的方法进行Lhca基因的相对定量,此外对同一时期不同组织Lhca四条基因的表达进行相对定量。本论文QRT-PCR采用SYBR-GreenⅠ嵌合荧光与熔解曲线结合法检测Lhca基因家族成员。本论文得出如下结论:（1） LhcaPe01基因cDNA全长为1051 bp,序列从第39 bp开始到第779 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,编码246个氨基酸。在5′端有38 bp的非编码区,在3′端含有242 bp的非编码区和Poly（A）30 bp。此外,通过DNASTAR软件预测,LhcaPe01编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.4000和22107.34Da。通过ExPASy网站对序列进行分析得出:核酸序列中与光合相关的信号区有2个4Fe-4S铁还原氧化蛋白的信号区和2个2Fe-2S铁还原氧化蛋白的信号区。该基因编码的氨基酸序列含有3个蛋白激酶C磷酸化位点;2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;5个N-肉豆蔻酰位点;2个叶绿素a/b结合蛋白位点。（2） LhcaPe02基因cDNA全长为1100 bp,序列从第74bp开始到第862bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,编码262个氨基酸。在5′端有73 bp的非编码区,在3′端含有234 bp的非编码区和Poly（A） 14bp。LhcaPe02编码的蛋白质等电点和分子量分别为6.14和28095.11 Da。该基因序列含有2个4Fe-4S铁还原氧化蛋白的信号区,推导的氨基酸序列中含有氨基化合物位点为、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-肉豆蔻酰位点和叶绿素a/b结合蛋白位点。（3）LhcaPe03基因cDNA全长为1149 bp,序列从第76 bp开始到第861 bp含有1个开放阅读框（open reading frame, ORF）和一个中止密码子,编码261个氨基酸。在5′端有75 bp的非编码区,在3′端含有288 bp的非编码区和Poly（A） 27 bp。LhcaPe03编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.08和27686.79 Da。该基因核酸序列含有3个2Fe-2S铁还原氧化蛋白的信号区和2个4Fe-4S铁还原氧化蛋白的信号区,推导的氨基酸序列中含有氨基化合物位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-肉豆蔻酰位点和叶绿素a/b结合蛋白位点,还有一个yiaA/B two helix domain。（4）LhcaPe04基因部分cDNA为1071 bp的基因,含有完整的编码框,序列第1 bp开始到第738 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,编码245个氨基酸。5′端未克隆出非编码区,在3′端含有304 bp的非编码区和Poly（A） 29 bp。LhcaPe04编码的蛋白质等电点和分子量分别为6.95和26898.83 Da。该基因核酸序列含有2个2Fe-2S铁还原氧化蛋白的信号区,推导的氨基酸序列中含有蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰位点、N-糖基化位点和叶绿素a/b结合蛋白位点。（5）通过NCBI Blast软件分析得出与毛竹Lhca基因同源性较高的物种是水稻和大麦。毛竹Lhca四条基因之间的核酸序列同源性高于推导的氨基酸序列的同源性。四条基因编码的四种蛋白分子二级结构组成,LhcaPe01与其它三条基因差别较大,而LhcaPe02、LhcaPe03和LhcaPe04三者之间差别不明显。根据SWISS MODEL预测和模拟,毛竹、大麦、水稻和玉米Lhca四条基因编码的蛋白模型较相似,毛竹PSI四种蛋白之间的差异较大。（6）刚竹属三种竹种——红壳竹、毛竹和角竹保守区内核酸序列同源性非常高,Lhca1基因的同源性高达99%以上;Lhca2基因的同源性高达98%以上。总体而言,同属竹种的同源性高于毛竹与禾本科的水稻和大麦;三个竹种Lhca1基因的同源性又相对高于Lhca2基因,说明刚竹属内竹种的Lhca1基因比Lhca2基因更保守。（7）PSΙ四条基因Lhca1～4在不同组织——新叶、老叶、茎尖、茎秆和笋中都有表达,但在不同组织中的表达水平存在差别。Lhca1基因在新叶中的表达量最高;Lhca2基因在老叶中的表达量最高;Lhca3基因和Lhca4基因在茎尖中的表达量最高。四条基因的表达量在不同组织中均以Lhca1基因最高;所有样品中以Lhca3基因在笋中表达量最低;四条基因在茎尖中的表达量均较高。（8）不同光照处理的叶片,PSΙ四条基因表达量顺序均为Lhca1>Lhca4>Lhca2>lhca3,强光下表达下调,弱光下表达上调,上调和下调的幅度不同。光强为3000μmol·m-2·s-1时,四条基因表达都出现下调,表达量分别是正常的89.5%,30.6%,48.3%,63.9%;下调幅度顺序为Lhca2>Lhca3>Lhca4>Lhca1。光强为2000μmol·m-2·s-1时,表达量分别是正常的27.9%,17.8%,69.7%,35.1%;下调幅度顺序为Lhca2>Lhca1>Lhca4>Lhca3。光强为1600μmol·m-2·s-1时,表达量分别是正常的73.3%,51.8%,35.7%,85.4%;下调幅度顺序为Lhca3>Lhca2>Lhca1>Lhca4。低光处理20天后叶片的相对表达量基本升高。光强为1000μmol·m-2·s-1时,四条基因表达都出现上调,表达量分别是正常的116.7%,115.4%,187.9%,102.4%;上调幅度顺序为Lhca3>Lhca1>Lhca2>Lhca4。光强为500μmol·m-2·s-1时,Lhca1、Lhca3、和Lhca4基因表达上调,Lhca2基因基本不变;表达量分别是正常的237.4%,99.1%,122.2%,147.5%;上调幅度顺序为Lhca1>Lhca4>Lhca3>Lhca2。光强为10μmol·m-2·s-1时,表达量分别是正常的607.2%,168.5%,219.2%,149.6%;上调幅度顺序为Lhca1>Lhca3>Lhca2>Lhca4。1600μmol·m-2·s-1光强表达量随时间的变化为:四条基因变化均呈一直下降趋势,先陡后缓。10和500μmol·m-2·s-1光强表达随时间延长,四条基因均先急速上升,然后缓慢下降,最终到达一个平衡点。