玉米C型细胞质雄性不育系及其保持系花药SSH文库构建

论文摘要

杂种优势的利用是提高作物单位面积产量的有效途径。玉米（Zea mays L.）是世界上最早利用杂种优势的作物之一。利用不育系进行杂交制种可以免去人工去雄,降低了劳动成本、提高了种子纯度。为了更好地发挥玉米不育系在杂种优势利用中的作用,探讨玉米雄性不育的分子机理,本研究以不育系C48-2及其保持系N48-2为材料,采集这两个材料处于花药发育的四分体时期、单核期和双核期的雄穗,剥取花药。使用Trizol法分别提取这两种材料三个时期的总RNA,然后将不育系和保持系材料三个不同发育时期的总RNA分别等量混合,利用磁珠分离法纯化出mRNA。将这两组mRNA分别反转录得到C48-2和N48-2的cDNA。利用抑制消减杂交和T/A克隆技术分别构建C48-2和N48-2的正向和反向文库。利用斑点印迹杂交技术进行阳性克隆的筛选,通过测序寻找不育系与保持系花药发育的差异表达基因。主要结果如下:（1）通过两次消减和两次PCR扩增,获得以不育系C48-2为tester,保持系N48-2为driver的正向消减产物;以N48-2为tester,C48-2为driver的反向消减产物。将这两组差异片段分别连接到PMD-19载体上,进行热激转化,并结合蓝白斑筛选分别构建了包含425个克隆的正向SSH文库,包含220个克隆的反向SSH文库。（2）随机选取文库的菌液进行PCR扩增,检测出插入片段的长度介于200～750 bp之间,平均长度在300 bp左右。（3）将同一文库的菌液PCR产物变性后点制到尼龙膜上制成高密度点阵膜,使用随机引物法对C48-2和N48-2的cDNA进行地高辛标记得到C48-2探针和N48-2探针。最终从正向文库中筛选到阳性克隆11个,从反向文库中筛选到阳性克隆12个。经测序后序列间同源性比对,共获得21条唯一的EST序列,其中来源于正向文库的EST序列10条,来源于反向文库的EST序列11条。（4）将筛选获得的22条EST序列提交到Genbank进行Blast比对,共获得已知基因功能的EST序列14条,已知RNA序列6条,新发现EST序列1条。对已知基因功能进行分类后发现筛选的差异表达基因共涉及信号传导、转录调控、初级代谢、次级代谢等功能。结合本实验获得的功能基因的相关信息推测导致细胞质雄性不育的原因有以下几点:（1）Ca2+信号转导异常本研究中得到1个与Ca2+信号转导相关基因,该基因所编码蛋白的功能是束缚Ca2+,在C48-2中下调表达,推测是由于缺乏该蛋白导致Ca2+异常释放,使CDPK的磷酸化受阻,从而导致花粉在发育期处于无碳源供给状态,使花粉正常发育所需的碳源受阻。这一结果与在玉米CMS-S研究中的报道相一致。（2）细胞凋亡在植物中,细胞凋亡参与了许多正常发育和生理过程,其中雄花发育过程中花药组织的细胞凋亡会引起雄性不育。已有研究表明玉米CMS-S的配子败育与PCD有关。本研究中得到4条与细胞凋亡有关的基因,其中aspartic proteinasenepenthesinⅡ在C48-2中下调表达,推测其为抑制细胞凋亡基因。programmed celldeath 2-lik、ω-3脂肪酸去饱和酶（omega-3 fatty acid desaturase）、乙烯受体（ethylenereceptor）则在C48-2中上调表达。而这三个基因均是参与细胞凋亡的重要基因。（3）与淀粉相关的物质代谢异常。在雄花发育过程中,花粉中诸如淀粉、蔗糖等内含物的数量和组分与花粉育性密切相关。研究中,有两个基因涉及到淀粉物质的积累。丙氨酸转氨酶（alanineaminotransferase,ALT）是糖异生途径中调控丙酮酸形成的主要酶,而丙氨酸到丙酮酸的转化是糖异生的关键起始反应。6-磷酸葡萄糖脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase）是糖酵解磷酸戊糖途径的关键酶,推测这两种酶的异常表达与雄花不育密切相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 植物雄性不育研究
• 1.1.1 雄性不育的概念和意义
• 1.1.2 雄性不育的分类
• 1.1.3 玉米细胞质雄性不育
• 1.1.3.1 玉米细胞质雄性不育的分类
• 1.1.3.2 玉米细胞质雄性不育细胞学研究
• 1.1.3.2.1 T型细胞质雄性不育的细胞学
• 1.1.3.2.2 S型细胞质雄性不育的细胞学
• 1.1.3.2.3 C型细胞质雄性不育的细胞学
• 1.1.3.3 玉米细胞质雄性不育的分子生物学研究
• 1.1.3.4 玉米CMS-C核基因的遗传
• 1.1.4 细胞质雄性不育败育机理的相关研究
• 1.1.5 花粉发育相关基因的克隆及其表达
• 1.2 抑制消减杂交（SSH）技术
• 1.2.1 抑制消减杂交（SSH）技术发展史
• 1.2.2 SSH技术原理
• 1.2.3 SSH的优缺点
• 1.2.4 SSH与基因表达谱
• 1.3 研究目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 花药总RNA的提取及mRNA的分离
• 2.2.1.1 总RNA的提取
• 2.2.1.2 mRNA的分离
• 2.2.2 SSH文库的构建
• 2.2.2.1 cDNA第一链的合成
• 2.2.2.2 cDNA第二链的合成
• 2.2.2.3 Ras Ⅰ消化
• 2.2.2.5 第一次杂交
• 2.2.2.6 第二次杂交
• 2.2.2.7 第一次PCR扩增
• 2.2.2.8 第二次PCR扩增
• 2.2.2.9 PCR产物的回收
• 2.2.2.10 感受态细胞制备
• 2.2.2.11 差减文库的构建
• 2.2.2.12 文库插入片段的检测
• 2.2.2.13 SSH文库的筛选
• 2.2.2.13.1 探针标记
• 2.2.2.13.2 文库高密度点阵膜的制备
• 2.2.2.13.3 杂交
• 2.2.3 克隆产物测序及序列比对
• 3. 结果与分析
• 3.1 花药总RNA的提取及检测
• 3.2 mRNA的纯化及检测
• 3.3 抑制消减杂交结果及分析
• 3.4 抑制消减杂交文库的构建
• 3.5 文库插入片段的检测
• 3.6 斑点印迹杂交筛选
• 3.7 阳性克隆测序
• 3.8 部分序列分析
• 3.8.1 C2-G2片段核酸序列及同源性分析
• 3.8.2 N3-E1片段核酸序列及同源性分析
• 4. 讨论
• 4.1 关于花药发育与RNA含量关系
• 4.2 文库构建中的影响因素分析
• 4.3 关于斑点印迹杂交筛选法的应用
• 4.4 CMS-C不育相关基因分析
• 4.4.1 信号转导与细胞质雄性不育
• 4.4.2 细胞凋亡与细胞质雄性不育
• 4.4.3 物质代谢与细胞质雄性不育
• 4.5 拟进一步开展的工作
• 5. 参考文献
• 致谢