与三种AcMNPV蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的筛选和鉴定

论文摘要

杆状病毒是目前所有己知病毒中对人类最为有益的病毒之一,它不仅可以作为重要的无公害生物杀虫剂,而且可作为真核表达载体系统表达外源基因,在药物研发、疫苗生产等方面有广泛的应用。病毒与宿主细胞的相互作用一直以来是病毒学界的研究热点。研究杆状病毒编码蛋白与宿主细胞蛋白因子之间的相互作用,进而揭示病毒在细胞中的运动途径,阐明病毒与宿主细胞的相互作用机制和病毒基因的功能具有很重要的意义。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）是杆状病毒的代表种。AcMNPV PK1是一个病毒结构蛋白,具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性。研究表明,PK1是极晚期基因的特殊转录因子,调控多角体蛋白基因启动子的活性。pk1同源基因存在于所有鳞翅目昆虫杆状病毒基因组。AcMNPV vubi基因编码的泛素蛋白与昆虫泛素同源,具有较高的序列相似度。AcMNPV的泛素蛋白在病毒出芽和释放过程中起作用,但是机制尚不明确。AcMNPV P6.9是一种富含碱性氨基酸的蛋白,在病毒体中与病毒DNA结合,为病毒核壳体组装所必需。其基因同源物存在于所有已完成测序的杆状病毒基因组。本研究分别以AcMNPV pk1、vubi和p6.9作为诱饵基因,通过酵母双杂交实验从AcMNPV的受纳细胞系Sf9细胞（草地贪夜蛾细胞系）的cDNA文库分别筛选病毒PK1、泛素和P6.9的互作蛋白基因,分析病毒-宿主蛋白的相互作用。以pk1为诱饵筛选出多组阳性cDNA克隆。序列分析结果显示,5组克隆的cDNA的预期编码产物可以从蛋白质数据库中检索到同源物。这些同源蛋白分别是：种RNA-结合蛋白（命名为10-5）、一种转录相关蛋白、RNA依赖性的DNA聚合酶、乙醇脱氢酶、蛋白质酪氨酸磷酸酯酶。分别克隆AcMNPV pk1和所筛选的Sf9细胞10-5基因至有His标签的表达载体,进行原核表达和表达产物纯化,制备其多克隆抗体。利用PK1和10-5蛋白特异性抗体与AcMNPV感染的Sf9细胞裂解液进行免疫共沉淀分析。为了进一步证实AcMNPV PK1与Sf9细胞10-5蛋白的相互作用,分别表达和纯化GST-10-5和MBP-PK1融合蛋白,进行GST pull-down分析。此外,用pk1的瞬时表达质粒转染Sf9细胞时,受转染细胞发生破裂。以AcMNPV vubi为诱饵筛选出两个与病毒泛素相互作用的Sf9细胞蛋白质基因。这两个基因的预期编码产物分别是细胞泛素和一种RNA聚合酶相关蛋白。以AcMNPV p6.9为诱饵也筛选出两个与P6.9相互作用的Sf9细胞蛋白质基因。这两个基因的预期编码产物分别是一种核糖体蛋白和一种线粒体基质蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1、引言
• 1.1 杆状病毒概述
• 1.1.1 杆状病毒简介
• 1.1.2 杆状病毒的分类
• 1.1.3 杆状病毒的双相复制周期
• 1.1.4 AcMNPV简介
• 1.2 AcMNPV的pk1基因
• 1.2.1 蛋白激酶
• 1.2.2 AcMNPV的蛋白激酶基因pk1
• 1.3 AcMNPV的泛素基因
• 1.3.1 泛素-蛋白酶体途径与病毒的关系
• 1.3.2 杆状病毒的泛素基因
• 1.4 ACMNPV的p6.9基因
• 1.5 蛋白质相互作用的研究
• 1.5.1 病毒与宿主细胞的相互作用
• 1.5.2 杆状病毒与宿主细胞相互作用研究
• 1.5.3 蛋白质相互作用的研究方法
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2、材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 细胞和病毒
• 2.1.3 工具酶和试剂盒
• 2.1.4 化学试剂
• 2.1.5 常用储存液
• 2.1.6 常用缓冲液
• 2.1.7 培养基
• 2.1.8 酵母双杂交所用试剂
• 2.1.9 聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）及Western blot blotting所用试剂
• 2.1.10 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因克隆操作方法
• 2.2.2 酵母双杂交筛选草地贪夜蛾细胞系IPLB-Sf9 cDNA文库
• 2.2.3 蛋白PK1和10-5的表达、纯化与多克隆抗体制备
• 2.2.4 体外pull down实验
• 2.2.5 Sf9细胞培养及病毒感染
• 2.2.6 免疫共沉淀
• 2.2.7 细胞转染
• 3、实验结果
• 3.1 与AcMNPV PK1相互作用的Sf9细胞蛋白的筛选和鉴定
• 3.1.1 与AcMNPV PK1相互作用的Sf9细胞蛋白基因的筛选
• 3.1.2 AcMNPV PK1与Sf9细胞10-5的相互作用分析
• 3.1.3 AcMNPV pk1瞬时表达对Sf9细胞的影响
• 3.2 与AcMNPV泛素蛋白相互作用的Sf9细胞蛋白基因的筛选和鉴定
• 3.2.1 诱饵载体pGBKT7-vubi载体的构建
• 3.2.2 BD-UBI融合蛋白的自激活和毒性检测
• 3.2.3 病毒泛素可能与多个Sf9细胞蛋白发生相互作用
• 3.3 与AcMNPVP6.9蛋白相互作用的Sf9细胞蛋白基因的筛选和鉴定
• 3.3.1 诱饵载体pGBKT7-p6.9载体的构建
• 3.3.2 BD-P6.9融合蛋白的自激活和毒性检测
• 3.3.3 P6.9可能与多个Sf9细胞蛋白发生相互作用
• 4、讨论
• 4.1 酵母双杂交技术在病毒学研究中的应用
• 4.2 AcMNPV PK1与Sf9细胞蛋白的相互作用
• 4.3 杆状病毒泛素的作用
• 参考文献
• 在校期间撰写论文
• 致谢