氨转运体Rhbg和Rhcg在低蛋白饮食大鼠肾脏的表达和调控

论文摘要

研究背景酸碱平衡在很大程度上依赖于氨的代谢。在过去的数年内关于氨代谢产生了许多新的观点。由于机体不断产生内源性和外源性的酸性代谢产物,机体必须产生新的碳酸氢盐以补偿机体碱的消耗,大约60～70%新产生的碳酸氢盐与氨的代谢有关。最近有新的观点认为氨的转运不但依靠非离子化的NH3扩散,而且依靠特殊转运蛋白实现。氨产生于近端肾小管,是由谷氨酰胺代谢产生的。在近端肾小管上皮细胞线粒体中,谷氨酰胺在谷氨酰胺酶及谷氨酸脱氢酶的作用下生成氨,一分子谷氨酰胺完全代谢可产生两分子NH4+,同时生成两分子碳酸氢钠。上皮细胞产生的碳酸氢钠通过基侧膜进入。肾静脉以补偿机体的碱消耗;产生的氨一部分进入肾小管腔,另一部分进入肾静脉,之后进入肝脏合成尿素。在近端肾小管,氨以NH4+的形式分泌入肾小管腔。此处NH4+的转运主要依赖上皮细胞顶端膜上的Na+/H+交换体NHE-3。近端肾小管产生的氨大部分在髓袢升支粗段被重吸收。由于髓袢升支粗段氨的重吸收作用,到达远端肾小管的氨仅为终尿氨的20%。终尿中的氨80%来自集合管的分泌,集合管氨的转运主要是以NH3形式通过扩散和转运蛋白介导的方式进行的。新近发现此处介导氨转运的蛋白为Rh（Rhesus）糖蛋白。Rh糖蛋白包含在由氨运载体AMT（ammonium transporter）、甲氨透明质酸酶MEP（mythylamine permease）和Rh糖蛋白共同构成的与氨转运有关的膜蛋白超家族中。上述蛋白广泛存在于酵母、植物、细菌和许多生物体内,其中AMT主要表达于植物,MEP主要存在于酵母菌,Rh糖蛋白主要表达于动物。研究证明当氮的来源缺乏时,植物根系AMT的转录水平明显增加;外界氮来源的减少诱导酵母菌MEP的表达增加以调控细菌从外界获取氨,证实MEP还可能作为一个缓冲体系以补偿氨的漏出;其他研究提示MEP有氮的感应器的作用。在动物和人类,三个Rh糖蛋白已经被发现并被克隆,他们分别是RhAG/Rhag、RhBG/Rhbg、RhCG/Rhcg。RhAG/Rhag是红系相关性蛋白,RhBG/Rhbg、RhCG/Rhcg是非红系相关性蛋白。有证据显示Rhbg和Rhcg在肾脏氨的代谢和转运中起关键作用。Rh家族蛋白,包括红系相关蛋白Rhag和非红系相关蛋白Rhbg和Rhcg,都发现与AMT和MEP在序列方面有高度的保守性。低蛋白饮食会造成动物体内氮来源的减少,在低蛋白饮食条件下动物是否能产生与植物和酵母菌相似的变化?Rh糖蛋白是否会在外界蛋白摄入减少的情况下发生变化?以上问题目前尚不清楚,因此本实验通过探讨低蛋白饮食条件下大鼠。肾脏Rhbg和Rhcg表达的变化,从而阐明氨离子通道Rhbg和Rhcg在低蛋白饮食大鼠酸碱调控中的作用,从新的视角探讨肾脏对氨的调控机制,加深对肾脏酸碱调控的认识。目的观察氨转运蛋白Rhbg和Rhcg对低蛋白饮食大鼠肾脏基因、蛋白质和亚肾单位表达的影响。方法1、取低蛋白饮食组和正常对照组大鼠的血清,利用全自动生化分析仪测定血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、tCO2、pH、HCO3-、血Na+、血K+、血Cl-。取低蛋白饮食组和正常对照组大鼠的尿液,检测尿氨、尿电解质、尿肌酐,计算电解质清除率(FENa+、FEK+、FECl-)。2、利用western blot分别检测低蛋白饮食组和正常对照组氨转运蛋白Rhbg和Rhcg在大鼠肾脏皮质、内髓、外髓的表达。3、利用real time-PCR分别检测低蛋白饮食组和正常对照组氨转运蛋白Rhbg和Rhcg基因在大鼠肾脏皮质、内髓、外髓的表达。。4、利用定量免疫组化的方法检测低蛋白饮食组和正常对照组氨转运蛋白Rhbg和Rhcg在肾小管主细胞和暗细胞表达的变化。结果1、在两组大鼠血清中,低蛋白饮食组的BUN明显降低（P＜0.05）,血清肌酐、血钾、血钠、血氯在两组间无明显的差别。2、在两组大鼠尿液中,低蛋白饮食组的尿钠明显降低,尿氨、尿肌酐、尿钾、尿氯两组间无明显的差别。3、Western blot显示低蛋白饮食可以明显增加Rhbg在大鼠肾脏皮质部的表达（P＜0.05）,但不改变Rhbg在内髓和外髓的表达。Rhcg在两组大鼠肾脏的皮质部、内髓和外髓的表达无明显变化。4、Real Time PCR显示两组大鼠肾脏的皮质部、内髓和外髓部Rhbg和Rhcg mRNA表达无明显差别。5、定量免疫组化染色技术提示在低蛋白饮食组大鼠肾脏皮质集合管的主细胞和暗细胞中,Rhbg的表达明显增强（P＜0.05）;内髓集合管和外髓集合管的主细胞和暗细胞Rhbg的表达无明显改变。6、免疫组化染色技术提示Rhcg在两组大鼠肾脏的皮质部、内髓和外髓的表达无明显变化。结论低蛋白饮食增加Rhbg在大鼠肾脏皮质集合管主细胞和暗细胞的表达,该作用独立于mRNA水平的变化。在低蛋白饮食大鼠肾脏调控中,Rhcg介导的氨转运可能不起作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 试验研究 Rcnal expression of the ammonia transporters,Rhbg and Rhcg,in response to low protein
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 英文缩略词表
• 个人简介
• 致谢