论文摘要
Sir2 （silence information regulator 2）蛋白家族是一种保守的从古细菌到哺乳动物都广泛存在的NAD+依赖的组蛋白/非组蛋白Ⅲ类去乙酰化酶。Sir2类蛋白（sirtuins）在基因沉默、神经系统、生物长寿等方面都具有重要的调节作用。从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条基因序列,经NCBI序列比对后推测该基因编码Sir2相关蛋白,将其命名为BmSir2。该基因ORF全长1164bp,编码387个氨基酸残基,GenBank登录号为NM001043472。该蛋白含有1个SIR2超级族中SIRT1结构域,预测该蛋白分子量为43.37 kD,等电点为4.94。我们将BmSir2基因克隆到pET-28a （+）载体中,并转化大肠杆菌Rosetta细胞进行表达。活化的重组表达菌用IPTG进行诱导后,菌体经SDS-PAGE电泳分析,在45 kD左右可观察到一条特异性条带,与预测的目的蛋白大小相符（带His标签大小为47.87 kD）。重组蛋白BmSir2经镍柱纯化后得到高纯度的重组蛋白,并用此免疫雄性新西兰兔,制备多克隆抗体。ELISA检测抗体血清效价达到1：12800,且Western blot检测抗体特异性良好。将家蚕各发育时期和五龄期各组织的总蛋白用自制的多克隆抗体进行检测,了解BmSir2在家蚕各时期和各组织的表达情况。实验结果表明,BmSir2在家蚕卵、蛹、蛾、五龄幼虫期都有表达但表达量不一,在卵期表达量最高,五龄期则最少。因此推测该蛋白在家蚕整个生长周期中都具有重要作用。在五龄幼虫各组织中BmSir2的表达情况差异也很明显,该蛋白只在丝腺中部、脂肪体、气管和头部等组织中有明显表达,在其它组织中则没有明显的表达信号。对家蚕BmN细胞进行目的蛋白亚细胞定位,结果表明BmSir2蛋白主要定位在细胞质中,细胞核中也有少量存在。
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摘要Abstract缩略语第一章 Sir2研究进展引言1 Sir2蛋白的发现和命名2 Sir2蛋白的结构特征和酶活性3 Sir2蛋白的功能3.1 Sir2与染色体沉默3.2 Sir2与能量限制3.3 Sir2与生物长寿3.4 Sir2与癌变3.5 Sir2与神经系统保护4 展望第二章 实验方案设计1 研究的目的与意义2 研究内容3 实验流程图第三章 生物信息学分析1 生物信息学工具2 方法3 结果3.1 BmSir2核苷酸序列及预测的蛋白序列3.2 疏水性分析3.3 BmSir2亚细胞定位分析3.4 BmSir2二级结构预测3.5 BmSir2三级结构预测3.6 BmSir2同源性分析3.7 进化树分析4 结论第四章 原核表达、纯化1 材料与试剂1.1 材料与设备1.2 试剂1.3 常用试剂配方2 方法2.2 BmSir2基因重组质粒的构建2.3 重组克隆的筛选与鉴定2.4 pET-28a（+）-BmSir2的诱导表达和纯化2.5 重组蛋白表达鉴定2.6 融合蛋白BmSir2镍柱纯化2.7 融合蛋白的FPLC纯化2.8 融合蛋白质谱鉴定3 实验结果3.1 PCR扩增目的片段3.2 重组质粒PCR和酶切鉴定3.3 BmSir2重组蛋白表达及鉴定3.4 FPLC分离纯化3.5 质谱鉴定4 实验结论第五章 多克隆抗体制备、纯化及检测1 试剂与材料1.1 材料与设备1.2 试剂1.3 常用试剂配方2 方法2.1 Bradford法测定蛋白浓度2.2 抗原制备2.3 免疫动物2.4 多克隆抗体血清的制备3 实验结果3.1 抗体纯化3.2 抗体效价测定ELISA结果3.3 Western Blot检测抗体特异性4 结论与讨论第六章 家蚕BmSir2表达分析1 材料与试剂1.1 材料与设备1.2 试剂1.3 常用试剂配方2 方法2.1 家蚕各时期及各组织蛋白提取2.2 Western blot检测BmSir2蛋白在家蚕各发育时期的分布2.3 Western blot检测BmSir2在五龄幼虫各组织中分布3 实验结果3.1 家蚕BmSir2各发育时期表达情况3.2 五龄幼虫各组织中BmSir2表达情况4 结论与讨论第七章 BmSir2蛋白亚细胞定位1 材料与试剂1.1 材料与仪器1.2 试剂1.3 试剂的配制2 方法3 实验结果4 结论与讨论总结参考文献致谢
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