子痫前期蜕膜组织比较蛋白质组学研究

论文摘要

子痫前期（pre-eclampsia）是妊娠期特有疾病,是妊娠高血压疾病的最常见类型,起病于34孕周前的重度子痫前期称为早发型重度子痫前期（early onset severe pre-eclampsia,ES-PE）,在34孕周以后发病的重度子痫前期称为晚发型重度子痫前期（late onset severepre-eclampsia,LS-PE）。目前子痫前期仍然没有理想的标志物,具体的发病机制仍未阐明。近年研究发现早发型重度子痫前期与晚发型重度子痫前期不仅是发病时间上存在差异,在发病机制、临床靶器官损害、临床治疗及预后等方面都有明显不同。蛋白质组学是近年来发展的新技术,主要包含蛋白质分离、蛋白质鉴定和生物信息学三大部分,具有高通量和高灵敏度等优点。人体蜕膜组织是母胎界面重要组成部分,与胎儿滋养层直接接触,有参与母胎免疫耐受形成及维持妊娠的功能。为探讨子痫前期的发病机制和寻找该病的蛋白质标志物,既往国内外学者曾运用蛋白质组学技术对子痫前期患者的外周血、脑脊液、羊水和胎盘滋养细胞等进行了各种研究。关于子痫前期蜕膜组织的蛋白质组学研究尚未见报道。本实验利用蛋白质组学技术,通过比较早发型重度子痫前期、晚发型重度子痫前期患者和正常足月妊娠妇女蜕膜组织的蛋白表达差异,探讨引起子痫前期发生的可能因素及寻找子痫前期是否存在标志蛋白,为研究子痫前期的发病机制和诊断提供依据。第一章子痫前期蜕膜组织差异表达蛋白的分离与鉴定目的:探讨早发型重度子痫前期、晚发型重度子痫前期和正常足月妊娠各组蜕膜组织差异蛋白表达谱的变化,筛选出早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期相关蛋白。方法:正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期各6例,剖宫产术中取出蜕膜组织,采用一步抽提法制备各组蜕膜组织的总蛋白,应用双向凝胶电泳技术建立正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期蜕膜组织双向凝胶电泳图谱。PDQuest软件进行图像分析分别对各组蜕膜组织总蛋白的双向电泳图谱进行了分析比较,随机选择各组间的差异点共30个进行胶内酶解,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析获得肽质量指纹谱,搜寻蛋白质数据库鉴定蛋白质并进行初步功能分析。结果:1.建立了分辨率高、重复性好的正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期蜕膜组织的2-DE图谱,其中蛋白质点正常足月妊娠组（425±16）个,早发型重度子痫前期组（408±10）个,晚发型重度子痫前期组（436±13）个。2.PDQuest进行图像分析软件对三组2-DE图谱进行比较分析,以比值大于2或小于2的蛋白质斑点作为显著差异表达的蛋白质标准。随机选择9个晚发组和正常妊娠组的差异蛋白质点和11个早发组与晚发组中差异点和15个早发组与正常妊娠组中的差异点进行质谱鉴定分析,共鉴定出29种差异蛋白质。3.鉴定出29种蛋白质按功能分为10类:①细胞结构相关蛋白质（Chloride intracellular channel protein 1、F-actin capping proteinα1subunit、Actin,beta、keratin 19、vimentin、Myozenin-2、phosphatidylethanolamine binding protein）;②信号传导相关蛋白（phosphoglycerate kinasel[2.7.2.3]、AnnexinⅤ、AnnexinⅣ、RhoGDP-dissociation inhitor 1、Rho-GDPdissociation inhibitor 2）;③能量与代谢相关的酶类（protein disulfide isomerase[EC5.3.4.1]、cytidinedeaminase、glutathione transferase[EC2.7.2.3]、ATP synthase D chain）;④钙结合蛋白质（Sorcin、transgelin 2、Tropomyosinα4 chain）;⑤其他（fibrinogen double fragment、fibrinogen beta chain precursor、proteasome endopeptidase complex[3.4.5.1]P42 chain、hemoglobin betachain）;⑥抗氧化物酶类（superoxide dismutase）:⑦分子伴侣（endoplasmin precursor）;⑧运输蛋白（prihibitin）;⑨防御性蛋白（DJ-1protein、α1-antitrypsin precursor）;⑩未知蛋白（coiled-coildomain-containing protein 128）。结论:1.成功建立正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期蜕膜组织总蛋白质的2-DE图谱,共鉴定了出29种差异蛋白质。2.多个能量代谢相关的蛋白和多个凝血功能相关的蛋白在正常妊娠组和子痫前期组之间存在表达差异推测:母胎界面缺氧应激和血液高凝状态可能是子痫前期发病的关键环节。3.首次进行了早发型子痫前期的比较蛋白质组学研究,发现了早发型子痫前期蜕膜组织与晚发型子痫前期蜕膜组织相比存在差异蛋白,提示早发型子痫前期的发病机制可能不同于晚发型子痫前期。第二章AnnexinⅤ、Rho-GDI在各组蜕膜组织中的差异表达及其意义目的:验证蛋白质组学的结果,对部分差异表达蛋白质在正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期蜕膜组织中的mRNA及蛋白表达水平进行检测,分析其临床意义。方法:收集正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期各10例蜕膜组织,分别采用荧光实时定量PCR、Western blot和免疫组织化学技术分别对正常足月妊娠妇女、早发型重度子痫前期及晚发型重度子痫前期蜕膜组织中的AnnexinⅤ和Rho-GDI的mRNA及蛋白进行检测。结果:1.荧光实时定量PCR,Western blot和免疫组化等结果显示AnnexinⅤmRNA及蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中表达最高,晚发型子痫前期组中次之,早发型子痫前期中最低,正常妊娠组与早发组和晚发组差异有统计学意义（P＜0.05）,与蛋白质组学结果一致。2.荧光实时定量PCR、Western blot和免疫组化等结果显示Rho-GDI mRNA及蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中表达最高,早发型子痫前期组中次之,晚发型子痫前期中最低,正常妊娠组与早发组和晚发组差异有统计学意义（P＜0.05）,与蛋白质组学结果一致。结论:1.蜕膜组织中AnnexinⅤ和Rho-GDI各组间存在差异表达,差异表达水平与蛋白质组学结果基本一致。2.AnnexinⅤ在子痫前期蜕膜组织中表达下调,AnnexinⅤ的低表达可能与子痫前期高凝状态形成有关。3.Rho-GDI在子痫前期蜕膜组织中表达下调,Rho-GDI可能通过血压调节和缺氧应激等多个环节参与了子痫前期的发生发展。第三章α1-antitrypsin在子痫前期患者蜕膜组织中的表达和母体外周血中的浓度变化及其临床意义目的:对α1-antitrypsin在正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期蜕膜组织中的表达水平进行检测,验证蛋白质组学的结果,并研究母体外周血清α1-抗胰蛋白酶蛋白浓度变化和探讨其临床意义。方法:采用荧光实时定量PCR、Western blot和免疫组织化学技术检测α1-antitrypsin在正常足月妊娠、早发型重度子痫前期和晚发型重度子痫前期各10例蜕膜组织中的表达,酶联免疫吸附法（ELISA）检测每组各20例母体外周血清α1-antitrypsin的浓度。结果1.荧光实时定量PCR、Western blot和免疫组化等结果显示α1-抗胰蛋白酶mRNA及蛋白在正常妊娠组蜕膜组织中表达最高;早发型子痫前期组中次之;晚发型子痫前期中最低,差异有显著性意义（P＜0.05）。2.母体外周血清α1-antitrypsin的浓度在正常妊娠组表达最高（1.85±0.15g/L）;早发型子痫前期组中次之（0.77±0.14 g/L）和晚发型子痫前期中最低（0.42±0.07 g/L）,差异有显著性意义（P＜0.05）。结论:1.蜕膜组织中α1-antitrypsin各组间存在差异表达,差异表达水平与蛋白质组学结果基本一致。2.子痫前期α1-antitrypsin表达降低,α1-antitrypsin低表达可能参与子痫前期病理过程,可能是子痫前期高凝状态形成的重要原因之一。3.子痫前期外周血清中α1-antitrypsin表达降低,可能成为预测子痫前期候选指标。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 论文正文
• 前言
• 技术路线
• 第一章 子痫前期蜕膜组织差异表达蛋白的分离与鉴定
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 第二章 Annexin Ⅴ、Rho-GDI在各组蜕膜组织中的差异表达及其意义
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 1-antitrypsin在子痫前期患者蜕膜组织中的表达和母体外周血中的浓度变化及其临床意义'>第三章 α₁-antitrypsin在子痫前期患者蜕膜组织中的表达和母体外周血中的浓度变化及其临床意义
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 4.结论
• 总结
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要科研成果及奖励