花生维生素E合成关键酶基因（VTE3、HPT）的克隆、序列分析与γ-tmt基因的转化研究

论文摘要

维生素E是一种脂溶性抗氧化剂,对动、植物和人体都有非常重要的生理作用。然而天然维生素E只能由光合细菌和绿色植物合成,人体必须从外界摄取。植物油是人体摄取维生素E的主要途径。花生作为重要的油料作物,是人体所需维生素E的重要来源之一。本研究基于花生EST序列,结合RT-PCR技术以及以基因组DNA为模板的PCR扩增方法,首次从花生中克隆了维生素E合成途径的关键酶基因2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因（VTE3）和尿黑酸植基转移酶基因（HPT）,并且分别克隆了13个不同类型花生栽培品种和6个二倍体野生种的VTE3 DNA序列,在比较各序列同源性的基础上,对不同类型花生栽培品种是否有相同起源问题以及花生栽培种与各野生种之间的亲缘关系进行了分析探讨;利用农杆菌介导法将拟南芥γ-维生素E甲基转移酶基因（γ-tmt）转入花生栽培品种得到T0代和T1代阳性转化植株。取得的主要研究结果如下:（1）从丰花2号、兰娜1号和荔浦大花生3个栽培品种中分别克隆到2条VTE3 cDNA片段,命名为rVTE3-1和rVTE3-2。品种间相应序列同源性为100%。rVTE3-1和rVTE3-2的编码区长1059 bp,均编码351个氨基酸,二者核苷酸序列同源性97.8%,存在10个变异位点,其中8个为SNP变异;氨基酸序列同源性98.6%,存在5个氨基酸差异。（2）从花生栽培品种Krapt.st.16中克隆得到一条HPT cDNA片段,长1269 bp,命名为AhHPT。AhHPT最大开放阅读框为1230 bp,编码含有409个氨基酸残基,与大豆、苜蓿、木薯、拟南芥等16种植物的HPT蛋白序列同源性较高,为61.46% 79.71%。（3）从13个栽培品种分别克隆得到2条VTE3 DNA片段,命名为gVTE3-1和gVTE3-2。gVTE3-1在13个品种间核苷酸序列同源性为99.9%, gVTE3-2核苷酸序列同源性为100%。丰花2号gVTE3-1和gVTE3-2同源性96.6%,内含子存在36个SNP位点和3个限制性内切酶识别的多态性位点。从6个二倍体野生花生分别克隆得到一条VTE3 DNA片段,A染色体组4个野生种以及B染色体组野生种A. batizocoi的gVTE3同源性达99.9%以上,仅有2个碱基的差异。B染色体组野生种A. ipaensis的gVTE3与其余野生种gVTE3同源性相对较低,为97.0%。A. ipaensis的gVTE3与丰花2号gVTE3-2同源性100%;丰花2号gVTE3-1与A染色体组野生种的gVTE3同源性相对较高,最高为98.7%。进化树分析显示,丰花2号的gVTE3-2与A. ipaensis的gVTE3聚为一组;A染色体组4个野生种和B染色体组野生种A. batizocoi的gVTE3以及丰花2号gVTE3-1聚为一组。（4）得到164株具有PPT抗性并且PCR检测目的基因（γ-tmt）呈阳性的转基因植株,经扩繁后移栽成活T0代单株560个,获得其T1代种子;获得来自34个株系T1代单株356个,经PCR检测其中185个植株呈阳性,获得其T2代种子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 维生素E 的研究进展
• 1.1.1 维生素E 的分类与活性
• 1.1.2 植物体内维生素E 的合成途径
• 1.1.3 植物维生素E 基因工程的研究
• 1.2 花生属植物起源、分类及物种间亲缘关系研究
• 1.2.1 花生属植物的起源和分类
• 1.2.2 花生栽培种与二倍体野生种间亲缘关系的研究
• 1.3 农杆菌介导的花生遗传转化研究进展
• 1.3.1 农杆菌介导的遗传转化方法原理
• 1.3.2 花生再生体系研究进展
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 花生VTE3 和HPT 基因的克隆试验
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 植物材料
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.2.1 花生VTE3 的电子克隆及引物设计
• 2.1.2.2 根据花生EST 序列设计扩增HPT 的引物
• 2.1.2.3 花生幼果总RNA 的提取
• 2.1.2.4 总RNA 的检测
• 2.1.2.5 所提取RNA 的逆转录
• 2.1.2.6 目的基因VTE3 和HPT 的RT-PCR
• 2.1.2.7 花生基因组DNA 的提取
• 2.1.2.8 DNA 为模板PCR 扩增VTE3
• 2.1.2.9 目的基因的胶回收
• 2.1.2.10 目的片段与pEASY-T1 载体连接并转化大肠杆菌
• 2.1.2.11 阳性重组子鉴定和测序
• 2.1.2.12 序列分析
• 2.2 拟南芥γ-tmt 对花生的转化试验
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.1.1 植物材料
• 2.2.1.2 菌种和质粒
• 2.2.1.3 供试培养基
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 基因转化方法
• 2.2.2.2 转基因花生的鉴定
• 0 代转基因苗移栽'>2.2.2.3 T₀代转基因苗移栽
• 1 代转基因植株的种植'>2.2.2.4 T₁代转基因植株的种植
• 1 代转基因植株的PCR 检测'>2.2.2.5 T₁ 代转基因植株的PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 花生VTE3 的克隆及序列分析
• 3.1.1 花生VTE3 的电子克隆
• 3.1.2 花生总RNA 的提取及逆转录
• 3.1.3 花生VTE3 扩增及测序结果
• 3.1.4 花生VTE3 核苷酸序列分析
• 3.1.4.1 丰花2 号VTE3 核苷酸序列分析
• 3.1.4.1.1 cDNA 序列分析
• 3.1.4.1.2 DNA 序列分析
• 3.1.4.2 不同栽培品种VTE3 核苷酸序列分析
• 3.1.4.3 栽培种和野生种VTE3 序列的比对及系统进化分析
• 3.1.5 花生VTE3 核苷酸序列推导的氨基酸序列分析
• 3.1.6 花生与其它植物VTE3 编码的氨基酸序列同源性分析
• 3.2 花生HPT 的克隆及序列分析
• 3.2.1 引物设计及RT-PCR 扩增结果
• 3.2.2 AhHPT 推导的氨基酸序列分析
• 3.2.3 同源比对与系统进化树构建
• 3.3 拟南芥γ－tmt对花生的转化
• 3.3.1 γ-tmt 基因的花生转化及PPT 抗性植株的获得
• 3.3.2 抗性苗的PCR 检测
• 3.3.2.1 γ-tmt 基因的检测
• 3.3.2.2 bar 基因的检测
• 0 代转基因苗大田移栽'>3.3.3 T₀代转基因苗大田移栽
• 0 代转基因植株性状调查'>3.3.4 T₀代转基因植株性状调查
• 1 代转基因植株种植'>3.3.5 T₁代转基因植株种植
• 1 代转基因植株PCR 检测'>3.3.6 T₁ 代转基因植株PCR 检测
• 4 讨论
• 4.1 基于EST 的基因克隆策略
• 4.2 栽培花生两条VTE3 序列的鉴别方法
• 4.3 花生栽培种中HPT 基因的拷贝数
• 4.4 不同类型花生栽培种的起源
• 4.5 栽培花生与6 个二倍体野生种之间的亲缘关系
• 4.6 花生区组二倍体野生种的分组
• 4.7 花生转化苗大田移栽方法
• 5 结论
• 参考文献
• 附录1：主要化学试剂及缓冲液配制
• 附录2：常用培养基配方
• 图版
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 硕士学位论文内容简介及自评