红树林环境Micromonosporaceae的分离、初步鉴定及活性评价

论文摘要

从华南地区七个红树林保护区采集红树林土壤的混合样品,运用三种添加抗生素的选择性培养基分离红树林环境可培养的小单孢菌,在三种样品预处理下,本研究得到类似小单孢菌株共127株。同时,实验提取了环境样品的总DNA ,利用小单孢科的16S rDNA特异引物做为探针,进行PCR扩增。七个地区的扩增结果都是阳性,表明这七个地区都分布有小单孢科的菌株。实验检测了分离菌株的抗肿瘤、抗耐甲养西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的活性,其中具有抗肿瘤活性的菌株数为17株,活性比率为13.4 %;具有抗MRSA活性的菌株数为6株,活性比率为4.7 %。实验依据其在YE培养基上生长1周后的形态特征将127株菌分为13个组,从每组选出代表菌株进行初步鉴定,共选出18株。通过对这18株提取DNA进行16S rDNA的扩增并测序,得到其16S rDNA的核苷酸序列,利用多序列比对等工具对它们进行系统发育分析。菌株在系统发育树中被分成3个分支,分别归属于Micromonospora,Actinoplanes, Verrucosispora三个属。由分离结果分析比较,各个红树林环境都分布有小单孢菌科的菌株,但是由于各个地区的生理条件有差异,分离结果也表现地域差异性。在本实验的分离策略下,小单孢菌属在红树林Micromonosporaceae中是优势菌属。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 前言
• 1.1 小单孢菌科（MICROMONOSPORACEAE）的分类地位及研究方法
• 1.2 红树林土壤MICROMONOSPORACEAE 研究现状
• 1.3 从红树林中分离MICROMONOSPORACEAE 的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 分析软件
• 2.1.6 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 样品的采集和保存
• 2.2.2 土壤理化性质测定
• 2.2.3 样品预处理
• 2.2.4 选择性培养基
• 2.2.5 稀释涂布及培养
• 2.2.6 菌种纯化及保藏
• 2.2.7 发酵培养
• 2.2.8 活性检测
• 2.2.9 土壤样品总DNA 提取
• 2.2.10 放线菌DNA 提取
• 2.2.11 PCR 反应
• 2.2.12 PCR 产物的纯化
• 2.2.13 DNA 序列测定
• 2.2.14 核苷酸序列登录号
• 2.2.15 16S rDNA 的系统发育分析
• 2.2.16 细胞壁分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 红树林土壤理化性质及养分含量
• 3.2 红树林土壤针对MICROMONOSPORA 的生物勘探结果
• 3.3 不同红树林环境土壤样品中小单孢菌的分离
• 3.4 活性检测
• 3.4.1 细胞毒活性
• 3.4.2 抗MRSA 活性检测
• 3.5 菌株分组及代表菌株的选取
• 3.6 代表菌株的系统发育分析
• 3.6.1 代表菌株基因组 DNA 的提取
• 3.6.2 16S rDNA 的 PCR 扩增
• 3.6.3 PCR 产物的回收纯化
• 3.6.4 代表菌株的165 rDNA 序列分析
• 3.7 代表菌株的化学分析
• 3.7.1 细胞壁氨基酸分析
• 3.7.2 18 株放线菌的细胞壁糖份分析
• 4. 讨论
• 4.1 不同地区红树林样品对分离结果的影响
• 4.2 土样预处理方法及培养基对分离结果的影响
• 4.3 不同地区红树林分离到放线菌活性比较
• 4.4 16S RDNA 系统发育分析结果比较
• 4.5 关于小单孢菌分离菌株的分组
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 7. 致谢（ACKNOWLEDGMENTS）