功能化多壁碳纳米管的细胞毒性研究

论文摘要

目的碳纳米管（Carbon Nanotubes,CNTs）是一种非常重要的一维纳米材料,由于其独特的结构和物理化学性质,使得它在汽车制造、平板显示器、生物医药等领域有广阔的应用前景。但是它对生态环境、人类健康的影响目前还不是很清楚,有待于进一步研究。本课题通过对本实验室设计、合成的功能化多壁碳纳米管库进行的细胞毒性研究,发现了碳纳米管的表面修饰基团与细胞毒性之间的剂量效应关系,筛选出生物相容性较好的碳纳米管。在此基础上,以毒性差异较为显著的4种功能化碳纳米管作为研究对象,对其细胞毒性进行深入的探讨,为建立纳米材料的毒性数据库提供重要的参考数据。方法本研究选择人正常皮肤成纤维细胞NHFB（Normal HumanFibroblasts）和人肝癌细胞HepG2作为毒性筛选模型用于功能化多壁碳纳米管库（functionalized multi-walled carbon nanotubes library,f-MWNTs library）的筛选,细胞密度是4000个细胞/孔（96孔板）,f-MWNTs的浓度为200μg/mL。本实验首先通过相差显微镜观察细胞形态变化和WST-1方法测定细胞活力,对f-MWNTs库的细胞毒性进行了初步筛选。根据初级筛选结果,选择碳纳米管库中的MWNTs-002、MWNTs-003、MWNTs-004和MWNTs-005这4种功能化碳管进行以下几方面的研究:应用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy,TEM）观察NHFB细胞对f-MWNTs的摄入及其在细胞内的定位情况;分析了f-MWNTs对细胞内活性氧含量（Reactive Oxygen Species,ROS）的影响;对细胞周期（Cell Cycle,CC）受阻滞的情况进行了研究。结果1.功能化多壁碳纳米管库的细胞毒性筛选f-MWNTs对细胞存活率的影响呈现明显的剂量效应关系,而细胞的存活率则随时间的延长而有所升高;表面修饰有不同官能团的多壁碳纳米管的分散性有所不同,所表现出来的细胞毒性也存在着差异;经过f-MWNTs处理后,细胞存活率均在50%以上。其中以羧基化碳纳米管MWNTs-002对两种细胞活力的影响最为明显,对NHFB细胞和HepG2细胞的存活抑制率分别为47%和40%。2.细胞形态观察通过普通光学显微镜下的观察发现,经f-MWNTs处理的NHFB细胞的形态发生了很大改变。正常情况下,细胞应该呈纤维状,细胞的延展性较好,处理后细胞形态明显变得较为瘦弱,几乎呈丝状分布,细胞的延展性、贴壁性能变差,细胞数目少于对照组。细胞生长受到显著抑制,但没有表现出明显的死亡现象。3.功能化多壁碳纳米管在细胞内的定位MWNTs-002、MWNTs-003、MWNTs-004和MWNTs-005作用于NHFB细胞12h后,能够穿过细胞膜进入细胞质胞浆的空泡内,并引起细胞一定程度的损伤,如细胞核皱缩、细胞膜破损、细胞有凋亡小体出现、线粒体空泡化、细胞核内的常染色质减少等现象。4.细胞内活性氧含量的测定处理组细胞内活性氧含量有所升高,当f-MWNTs的作用浓度大于50μg/mL时,细胞内的活性氧含量显著提高,随处理时间的增长,细胞内活性氧含量反而有所降低。f-MWNTs的处理对细胞内活性氧的产生呈浓度依赖关系,但对处理时间则表现出负相关性。5.细胞周期分布情况不同浓度的羧基化MWNTs作用HepG2细胞12h后,细胞周期分布情况出现轻微的改变,与对照组相比,G0/G1期细胞百分数有所上升,G2/M期细胞百分数下降。其中,200μg/mL MWNTs-002作用于HepG2细胞12h后,G0/G1期细胞百分数为65.86%,而对照组为57.45%。将MWNTs-002、MWNTs-003、MWNTs-004和MWNTs-005以200μg/mL的浓度分别作用HepG2细胞6h、12h、24h和48h,与对照组细胞相比,所引起的细胞周期在G0/G1期的阻滞以12h最为明显。结论1.f-MWNTs的细胞毒性与其表面修饰的化学官能团有关,并且具有剂量依赖性;2.f-MWNTs的细胞毒性主要表现为抑制细胞增殖;3.f-MWNTs能够穿过细胞膜进入细胞,分布在细胞质的空泡内,并对细胞造成一定的损伤;4.f-MWNTs可以引发细胞内活性氧含量的升高,这可能是抑制细胞增殖的原因之一;5.f-MWNTs诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,阻滞效果与碳纳米管的表面修饰有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 纳米材料简介
• 1.1.1 纳米材料的特点及其应用
• 1.1.2 纳米材料毒理学研究现状
• 1.2 碳纳米管及其细胞毒理学研究现状
• 1.2.1 碳纳米管简介
• 1.2.2 碳纳米管细胞毒理学研究现状
• 1.2.2.1 碳纳米管细胞毒性的影响因素
• 1.2.2.2 碳纳米管细胞毒性的产生机制
• 1.2.2.3 碳纳米管细胞毒性的分子机制
• 1.2.2.4 碳纳米管细胞毒理学研究方法
• 1.3 组合化学简介
• 1.4 本课题的研究意义及创新性
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 主要实验材料
• 2.1.1 碳纳米管
• 2.1.2 细胞系
• 2.1.3 细胞培养的试剂及耗材
• 2.2 主要实验仪器
• 2.3 实验方法与操作步骤
• 2.3.1 功能化多壁碳纳米管库的合成及表征
• 2.3.1.1 功能化多壁碳纳米管库的合成
• 2.3.1.2 功能化多壁碳纳米管库的表征
• 2.3.2 碳纳米管分散液的制备
• 2.3.3 细胞培养
• 2.3.4 台盼蓝染色计数及细胞活性检测
• 2.3.5 细胞存活率检测
• 2.3.6 透射电子显微镜成像
• 2.3.7 细胞内活性氧检测
• 2.3.8 细胞周期检测
• 2.3.9 数据分析
• 第三章 实验结果
• 3.1 功能化多壁碳纳米管库的细胞毒性研究
• 3.1.1 功能化多壁碳纳米管库的分散性情况
• 3.1.2 细胞存活率检测
• 3.1.2.1 WST-1实验线性范围测定
• 3.1.2.2 功能化多壁碳纳米管库的细胞毒性研究
• 3.2 4种典型功能化多壁碳纳米管的细胞毒性研究
• 3.2.1 细胞存活率分析
• 3.2.2 细胞内定位情况分析
• 3.2.3 细胞内活性氧含量分析
• 3.2.4 细胞周期分布
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 附图和附表
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况