论文摘要
目的:通过建立大鼠心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia Reperfusion Injury,MIRI）动物模型,观察四种不同干预后心肌梗死面积、心肌细胞凋亡、Bcl-2和Bax的表达及血流动力学等相关指标的变化,探讨缺血后处理（ischemic postconditioning,IPO）对大鼠心肌细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响,为进一步研究Bcl-2家族在缺血后处理心肌保护机制中的作用提供理论资料。方法:选择40只280～300g试验用Sprague-Dawley（SD）大鼠（雌雄兼有）,随机分成4组,每组10只,每只都给予30 min缺血,120 min再灌注。即①缺血再灌注组（ischemic reperfusion,I/R组）:收紧结扎线阻断冠状动脉左前降支缺血30 min,放松结扎线再灌注120 min;②缺血后处理组（ischemic postconditioning,IPO组）:阻断冠状动脉左前降支缺血30 min后,给予再灌注20 s ,缺血20 s ,连续3个循环的缺血后处理,然后再灌注118 min;③HA14-1组:再灌注开始前30 min,腹膜腔内给予选择性Bcl-2抑制剂HA14-1（2㎎/㎏）,阻断冠状动脉左前降支缺血30 min后,再灌注120 min;④缺血后处理+ HA14-1组（ischemic postconditioning + HA14-1,IPO + HA14-1组）:再灌注开始前30 min,腹膜腔内给予选择性Bcl-2抑制剂HA14-1（2㎎/㎏）,阻断冠状动脉左前降支缺血30 min后,再灌注20 s ,缺血20 s ,连续3个循环的缺血后处理,然后再灌注118 min。所有动物术前禁食、禁水3 h,全麻后取仰卧位固定,四肢连接心电极,气管切开,呼吸机辅助呼吸。胸部前正中切口,剪开胸骨,显露心脏,分别给予肝素500 u/㎏,防止血栓形成。经胸廓壁在左室心尖部无血管区置入穿刺套管针,连接压力传感器及监测仪。观察指标:①心肌组织形态学检查:再灌注完毕后取左室心肌适量大小,常规固定、包埋、HE染色后行光镜观察。②心肌梗死面积测定:心脏缺血再灌注120 min后,迅速取下心脏,原位阻断LAD,经主动脉逆灌Even’s蓝,分离出左室心肌并横切成5片,置入氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸缓冲液（pH7.4）中,37℃水浴15 min,非坏死区染成砖红色,坏死区不染色呈灰白色,然后置于10%中性甲醛中固定过夜,分离坏死区与非坏死区后称重,梗死范围以坏死心肌质量占左室心肌质量的百分比表示。③心肌细胞凋亡指数（apoptotoc index,AI）:心脏再灌注完毕,完整地切下心脏,于左心室心尖部固定部位取适量全层心肌组织,按常规病理组织学方法制备心肌石蜡标本,采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ TdT-mediated dUTP NickEnd Labeling , TUNEL法）检测凋亡心肌细胞,按照原位凋亡检测试剂盒说明书介绍的方法操作。细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒且具备凋亡细胞形态学特征判定为凋亡细胞。光镜下根据凋亡阳性细胞分布情况,每张切片拍摄5个阳性视野,每视野计数300个心肌细胞中的凋亡阳性细胞数,以阳性细胞数所占观察心肌细胞的比例作为凋亡率,即心肌细胞凋亡指数（% ） =（凋亡心肌细胞核数/正常心肌细胞核数）×100%。④Bcl-2、Bax蛋白阳性表达指数（PEI）:免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白表达,每只大鼠取4张切片,光学显微镜下放大200倍,观察阳性细胞。Bcl-2、Bax以胞浆及胞膜内侧出现棕黄色颗粒为阳性。根据阳性细胞分布情况,每张切片随机取5个高倍视野,计数每个视野中的阳性细胞数和细胞总数,计算阳性细胞数所占百分比作为比值,再取平均值即为Bcl-2或Bax蛋白阳性表达指数（PEI）。⑤血流动力学指标:在LAD阻断前10 min、LAD阻断缺血30 min、LAD再灌注15 min、30 min、60 min、120 min,共6个时间点,分别用RM6240C生理信号采集系统记录心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压上升最大速率（+dp/dtmax）和左心室内压下降最大速率（-dp/dtmax）的波形及数值,并分析缺血前和再灌注末各项指标的变化。结果:①心肌组织形态学检查结果:光镜观察到I/R组心肌组织病理形态改变明显加重,IPO组病理改变较I/R组明显减轻;而IPO组、HA14-1组、和IPO + HA14-1组具有相似的病理形态学改变。②心肌梗死面积结果:分别为I/R组（76.63±4.84）、IPO组（46.99±2.82）、HA14-1组（76.51±3.47）、IPO + HA14-1组（75.67±4.57）。IPO组的梗死面积明显小于I/R组,差异有统计学意义（ p<0. 01）; I/R组、HA14-1组和IPO + HA14-1组之间,两两相比较,心肌梗死面积差异无统计学意义（p>0. 05）;IPO + HA14-1组心肌梗死面积明显高于IPO组,差异有统计学意义（p<0.01）。③心肌细胞凋亡结果:I/R组心肌组织中TUNEL阳性细胞明显增多,阳性细胞呈灶状分布;在IPO组心肌组织中TUNEL阳性细胞较少,散在分布。各组凋亡指数分别为I/R组（42.32±1.48）、IPO组（20.48±1.20）、HA14-1组（41.21±3.63）、IPO + HA14-1组（40.17±1.94）。IPO组凋亡指数明显低于I/R组,差异有统计学意义（p<0.01）,而IPO组、HA14-1组、和IPO + HA14-1组之间,两两相比较,差异无统计学意义（p>0. 05）。④Bcl-2、Bax蛋白阳性表达指数（PEI）:各实验组的PEI分别为I/R组（0.48±0.03,1.07±0.01）、IPO组（1.10±0.03,0.30±0.03）、IPO+ HA14-1组（0.47±0.05,1.06±0.04）、HA14-1组（0.46±0.06）、IPO+ HA14-1组（0.47±0.05,1.06±0.04）。在正常的心肌组织内Bcl-2和Bax mRNA的表达相对较低或不表达;I/R组Bcl-2 mRNA表达水平下降,Bax mRNA表达水平上升,Bax/Bcl-2比值升高;IPO组Bcl-2 mRNA表达水平上升,Bax mRNA表达水平下降,Bax/Bcl-2比值下降;IPO组与I/R组相比较,差异显著有统计学意义（p<0.01）;HA14-1组Bcl-2 mRNA表达水平较I/R组明显下降,Bax mRNA表达水平差异不显著,Bax/Bcl-2比值升高;IPO+ HA14-1组和I/R组相比较,Bax mRNA、Bcl-2 mRNA表达水平差异无统计学意义（p>0. 05）。⑤血流动力学的变化:缺血前四组动物的HR、LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax之间无差别（p>0.05）;缺血后30 min各组实验动物的LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax又下降趋势,HR有上升趋势,但是这种变化差异各组间无统计学意义（p>0.05）;再灌注15、30、60、120 min时,IPO组的LVDP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显高于I/R组（p<0.01）,HR明显低于I/R组; HA14-1组、IPO + HA14-1组和I/R组之间,各项血流动力学指标变化,无统计学差异（p>0.05）。各实验组LVEDP,在心脏恢复灌注15 min之内上升最明显,以后随再灌时间延长,LVEDP逐渐下降,IPO组及IPC组明显低于I/R组,差异有统计学意义（p<0.01）。结论: 1. IPO可减轻MIRI后心肌组织的病理形态学改变,减少心肌梗死面积,从而减轻心肌缺血再灌注损伤,对MIRI具有一定的保护效应。2. IPO能抑制心肌细胞凋亡。3. IPO显著减少心肌缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡的程度,可能与Bcl-2蛋白表达上调、Bax蛋白表达下调有关。4. IPO显著提高I/R后心肌的收缩能力和舒张能力,从而改善MIRI后的心功能。