苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体突变株的蛋白质组学分析

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是目前世界上使用最广泛的生物杀虫剂之一,为革兰氏阳性细菌,目前已分离到83个亚种,71个血清型。其高效杀虫活性源于杀虫晶体蛋白,该蛋白在稳定期大量表达、积累并装配成晶体。晶体代谢调控机制是目前研究苏云金芽胞杆菌研究的热点之一,因为到目前芽胞形成机制的研究已有了突破性的进展,但是目前关于晶体代谢调控的机制仍然没有一个合理并清晰的解释。本文从高毒菌株YBT1520出发,采用不同的诱变方法得到其晶体的突变株,然后采用2-DE的方法,通过质谱鉴定出蛋白差异的点。希望得到与晶体代谢调控相关的功能基因。1.利用宽氮离子束、紫外线+氯化锂复合诱变、微波+紫外线复合诱变、NTG+氯化锂复合诱变等诱变方法处理苏云金芽胞杆菌YBT1520,筛选得到了三种类型的突变株：晶体变大、晶体变小、无晶体的突变株。2.进行了稳定性传代实验,晶体变小和无晶体的突变株20代传代稳定；抽取YBT1520及突变株的质粒,发现晶体变小的突变株与野生株相比少了pBMB12这个质粒,而无晶体突变株的质粒图谱与野生株有较大的差异；测定了它们的生长曲线,晶体变小的突变株的生长趋势基本和野生株一致,但是无晶体突变株在进入稳定期后生长波动范围较大；测定了野生株和突变株的杀虫活性,结果显示晶体变小的突变株的杀虫活性与野生株相似,而无晶体突变株基本没有杀虫活性。根据突变株的信息以及实验目的,确定以晶体变小的突变株为双向电泳的材料。3.YBT1520晶体的大量表达始于对数期末期,并在稳定期积累装配形成晶体,据此选取14h、18h、22h三个时间点进行2-DE实验,PDQuest软件分析胶图,用质谱鉴定出了可信的表达差异较大的点13个,其中表达量上调的点有8个,下调的点有5个。结果包括：与代谢相关的酶类、伴侣蛋白、转录调节蛋白、翻译调节蛋白和未知功能的蛋白等5类。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白
• 1.1.2 杀虫晶体蛋白的表达与调控
• 1.1.2.1 转录水平的调控
• 1.1.2.2 转录后水平的调控
• 1.1.2.3 翻译水平的调控
• 1.2 诱变方法
• 1.2.1 物理诱变
• 1.2.2 化学诱变
• 1.2.3 新型诱变剂
• 1.3 蛋白质组学概述
• 1.3.1 蛋白质组学的技术进展
• 1.3.2 双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）及蛋白染色
• 1.3.4 影响蛋白质鉴定的因素
• 1.4 苏云金芽胞杆菌YBT1520的特性
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂与器材
• 2.1.3.1 试剂
• 2.1.3.2 向电泳中的各类缓冲液（Bio-Rad公司实验手册提供）
• 2.1.3.3 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 诱变方法
• 2.2.1.1 菌体悬浮液的配置
• 2.2.1.2 紫外线+氯化锂复合诱变法
• 2.2.1.3 微波+紫外线复合诱变法
• 2.2.1.4 NTG+氯化锂复合诱变法
• 2.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提
• 2.2.3 菌体悬浮液的配置
• 2.2.4 双向电泳
• 2.2.4.1 第一向等电聚焦（用自制溶液）
• 2.2.3.2 第二向SDS-PAGE电泳
• 2.2.3.3 注意事项
• 2.2.3.4 胶条的平衡
• 2.2.3.5 胶条的转移
• 2.2.3.6 SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.1. 突变
• 3.2 稳定性传代实验
• 3.3 生物测定
• 3.4 YBT1520及其突变株的生长曲线
• 3.5 YBT1520及其突变株的质粒图谱和SDS-PAGE
• 3.6 YBT1520及其突变株的双向电泳
• 3.7 展望
• 参考文献
• 致谢