β-胡萝卜素高产菌株的选育及代谢调控的初步研究

论文摘要

β-胡萝卜素是类胡萝卜素家族中的典型代表,具有极强的淬灭单线态氧和清除自由基的能力,在食品、医药、化妆品等领域有广阔的应用前景。三孢布拉霉（Blakeslea trispora）天然可产β-胡萝卜素,且具有容易培养、生物量大、产量高等优势,所以受到广泛关注。本论文以实验室保藏三孢布拉霉负菌作为出发菌株,经过紫外线诱变,以菌落颜色和β-胡萝卜素的产量为筛选指标,分别通过β-紫罗酮、二苯胺和洛伐他汀3种抗性平板对突变株进行定向选育。其中洛伐他汀的效果最佳,最适选择浓度为0.025%（W/V）。最终选育出一株β-胡萝卜素高产菌株UV-9。在未优化条件下,此突变株β-胡萝卜素的产量为2.06g/L,较出发菌株提高了49.3%,且遗传性能稳定。本论文以β-胡萝卜素产量作为主要参考指标,综合考虑三孢布拉霉代谢特征,对培养基成分和培养条件进行优化。最终确定三孢布拉霉发酵生产β-胡萝卜素的最佳培养基为:玉米粉4%,黄豆粉3%,棉籽油6%,KH2PO40.3%;正负比例为1:49;确定最优氧载体为过氧化氢,最优添加时间为48h,最优添加量为0.15%（V/V）。同时添加表面活性剂可以大量提高β-胡萝卜素的产量,其中添加Span效果最佳,添加量为0.1% （V/V）。在该最优条件下发酵,β-胡萝卜素的产量可达到3.35g/L。较未优化前提高了69.6%。本论文考察了不同代谢促进剂对三孢布拉霉菌体生长及产物代谢的影响。各种促进剂对β-胡萝卜素的代谢都有不同程度的改善。其中,β-紫罗酮的效果最为明显,由于其对早期菌体生长具有毒性,最佳补加时间为44h,添加浓度为0.15%（V/V）。本论文采用Vydac C18柱反相高效液相色谱法分析三孢布拉霉产物组份,β-胡萝卜素异构体得到了较好的分离,顺式异构体比例最高可达10.5%;在实验室条件下,分别制得β-胡萝卜素晶体和β-胡萝卜素油,经反相HPLC分析,晶体主要由反式β-胡萝卜素组成,而油中则含有大量的顺式异构体;实验还考察了不同因素对β-胡萝卜素提取液稳定性的影响。其中光对β-胡萝卜素提取液的稳定性影响最大。温度（60℃以下）对β-胡萝卜素的影响不大,在4℃和20℃下基本没有损失。Fe2+、Al3+的存在使β-胡萝卜素损失较多。抗氧化剂TBQH和BHT对β-胡萝卜素都有较强的保护作用, TBQH的保护作用比BHT稍强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 β-胡萝卜素的结构与性质
• 1.3 β-胡萝卜素的来源与合成
• 1.3.1 天然物萃取法
• 1.3.2 化学合成法
• 1.3.3 生物合成法
• 1.4 β-胡萝卜素的应用领域
• 1.4.1 医药用途
• 1.4.2 食品添加剂
• 1.4.3 日用化妆品
• 1.4.4 饲料添加剂
• 1.5 三孢布拉霉中β-胡萝卜素的生物合成及代谢调控
• 1.5.1 三孢布拉霉
• 1.5.2 三孢布拉霉中β-胡萝卜素的生物合成途径
• 1.5.3 三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的代谢调控
• 1.6 微生物法生产β-胡萝卜素的国内外研究进展
• 1.6.1 国内β-胡萝卜素的生产及市场状况
• 1.6.2 β-胡萝卜素生物合成技术的研究概况和发展趋势
• 1.7 本课题的立题背景及研究意义
• 1.8 本课题的研究任务
• 第二章 高产β-胡萝卜素菌株的选育
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂与仪器
• 2.2.2 实验菌种
• 2.2.3 培养方法
• 2.2.4 分析方法
• 2.2.5 诱变方法
• 2.2.6 突变株的选育
• 2.2.7 遗传稳定性试验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 诱变剂量的选择
• 2.3.2 三孢布拉霉负菌的选育
• 2.3.2.1 二苯胺抗性突变株的筛选
• 2.3.2.2 β-紫罗酮抗性突变株的筛选
• 2.3.2.3 洛伐他汀抗性突变株的筛选
• 2.3.2.4 复筛结果
• 2.3.3 三孢布拉霉的形态及其生长特性
• 2.3.3.1 无性生殖
• 2.3.3.2 有性生殖
• 2.3.4 菌种退化及遗传稳定性
• 2.4 本章小结
• 第三章 摇瓶发酵条件的优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 菌种及培养方法
• 3.2.2.1 实验菌种
• 3.2.2.2 培养基
• 3.2.3 分析方法
• 3.2.3.1 生物量的测定
• 3.2.3.2 β-胡萝卜素的提取及含量计算
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵基本培养基的确定
• 3.3.2 接种方式对β-胡萝卜素合成的影响
• 3.3.3 氧载体和表面活性剂对发酵及产物代谢的影响
• 3.3.3.1 不同氧载体加入时间对发酵的影响
• 3.3.3.2 氧载体不同添加量对发酵的影响
• 3.3.3.3 加入氧载体的同时添加不同表面活性剂对发酵的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 代谢促进剂对三孢布拉霉生长及产物合成的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要试剂与仪器
• 4.2.2 菌种及培养方法
• 4.2.2.1 实验菌种
• 4.2.2.2 培养基
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 生物量的测定
• 4.2.3.2 β-胡萝卜素的提取及含量计算
• 4.2.3.3 发酵液中三孢酸的制备
• 4.2.3.4 发酵废液的回加
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 三孢布拉霉中β-胡萝卜素合成的主要代谢途径
• 4.3.2 三孢布拉霉发酵β-胡萝卜素的代谢曲线
• 4.3.3 几种代谢促进剂对三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的影响
• 4.3.3.1 三孢酸对三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的影响
• 4.3.3.2 柠檬酸对三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的影响
• 4.3.3.3 青霉素对三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的影响
• 4.3.3.4 β-紫罗酮对三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的影响
• 2+对三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的影响'>4.3.3.5 Mg²⁺对三孢布拉霉合成β-胡萝卜素的影响
• 4.4 本章小结
• 第五章 三孢布拉霉中β-胡萝卜素的提取和稳定性研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要试剂与仪器
• 5.2.2 菌种
• 5.2.3 实验方法
• 5.2.3.1 HPLC 法分离β-胡萝卜素顺反异构体
• 5.2.3.2 β-胡萝卜素保存率的测定[48]
• 5.2.3.3 菌丝体中β-胡萝卜素的提取和皂化
• 5.2.3.4 β-胡萝卜素标准品稳定性研究
• 5.2.3.5 干菌体中β-胡萝卜素的稳定性实验
• 5.2.3.6 结晶产品稳定性实验
• 5.2.3.7 光照对β-胡萝卜素稳定性影响
• 5.2.3.8 温度对β-胡萝卜素稳定性影响
• 5.2.3.9 金属离子对β-胡萝卜素稳定性的影响
• 5.2.3.10 抗氧化剂对β-胡萝卜素稳定性影响
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 菌丝体中β-胡萝卜素顺反异构体的分离
• 5.3.2 β-胡萝卜素的制备
• 5.3.2.1 β-胡萝卜素精制工艺
• 5.3.2.2 产品组成成分分析
• 5.3.3 β-胡萝卜素稳定性研究
• 5.3.3.1 不同状态β-胡萝卜素稳定性研究
• 5.3.3.2 几种因素对β-胡萝卜素提取液的影响
• 5.4 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文