妥布霉素生物合成基因的研究

论文题目: 妥布霉素生物合成基因的研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 微生物与生化药学

作者: 杨钧

导师: 夏焕章

关键词: 黑暗链霉菌,氨甲酰妥布霉素,生物合成基因簇,基因阻断

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 黑暗链霉菌H6(Streptomyces tenebrarius H6)产生三种抗生素：安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B。为研究其抗生素生物合成途径，对黑暗链霉菌H6染色体上的tbmA基因进行基因阻断实验，利用PCR获得tbmA基因内部863bp片段，构建基因阻断穿梭载体pSPU112，经接合转移导入黑暗链霉菌H6，筛选单交换阻断变株，并用Southern blot验证阻断变株的tbmA已经被破坏。经发酵产物分析，阻断变株不再合成氨甲酰妥布霉素，只合成安普霉素。首次从分子水平证明了tbmA只参与氨甲酰妥布霉素生物合成，而不参与安普霉素的生物合成。 为研究黑暗链霉菌H6中的妥布霉素生物合成基因簇，对李天伯等克隆得到约50kb连锁区域左右两端的片段(E片段、G片段)进行阻断实验，从而初步确定了此50kb区域中妥布霉素生物合成基因簇的大致范围。并通过Southern杂交的方法对此50kb区域与Madan Kumar Kharel等人克隆得到的13.8kb可能的妥布霉素生物合成基因簇间的关系进行初步研究，结果表明二者是完全独立的两个区域，并没有重叠的部分，因此推断50kb区域右侧未克隆到的部分仍包含妥布霉素生物合成基因，这为获得妥布霉素生物合成的完整基因簇，最终阐明妥布霉素生物合成途径奠定基础。 对50kb区域右端片段(G片段)进行酶谱分析和部分序列测定，发现一个完整的ORF和一个不完整的ORF。网上BlastX分析没有发现明显同源序列，推测为一个新基因，命名为tobH。利用tobH内部片段构建基因中断载体，通过接合转移导入黑暗链霉菌H6，发生同源单交换，获得阻断株H6(pSPU119)。Southern blot实验验证阻断位点正确，阻断株发酵组分中不再含有妥布霉素，表明tobH是妥布霉素生物合成途径中的重要基因。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

实验材料

实验方法

1.大肠杆菌质粒DNA小量提取

2.大肠杆菌质粒DNA大量提取

3.链霉菌质粒DNA的提取

4.链霉菌总DNA的提取

5.大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备

6.质粒DNA转化大肠杆菌

7.DNA酶切和连接

8.DNA电泳和片段回收

9.T_4 DNA聚合酶补平试验

10.PCR实验

11.接合转移实验

12.黑暗链霉菌发酵及检测操作的实验方法

12.1 发酵流程

12.2 抗生素组分检测

13.Southern blot杂交

13.1 DNA从凝胶转移至尼龙膜

13.2 探针标记

13.3 Southern杂交

结果与讨论

第一部分 黑暗链霉菌妥布霉素生物合成基因tbmA的功能研究

1.tbmA基因的功能研究

1.1 阻断载体的构建

1.2 接合转移实验

1.3 单交换基因阻断菌株的获得

1.4 基因阻断菌株体内游离质粒的考察

1.5 阻断变株的Southern blot杂交验证

1.6 阻断变株的发酵组分分析

1.7 基因重组菌株稳定性考察

2.讨论

第二部分 S.tenebrarius H6中妥布霉素生物合成基因簇初步研究

1.G片段的研究

1.1 G片段的初步研究

1.1.1 BamHI 9.0kb-G片段亚克隆和酶切图谱分析

1.1.2 克隆片段功能的初步研究

1.1.2.1 G片段阻断载体的构建

1.1.2.2 接合转移实验

1.1.2.3 基因阻断菌株的获得

1.1.2.4 阻断变株的发酵组分分析

1.1.2.5 阻断变株H6(pSPU106)的Southern blot杂交验证

1.1.2.6 基因阻断菌株H6(pSPU106)稳定性考察

1.2 G片段的进一步序列分析

1.2.1 G片段的酶谱分析及亚克隆

1.2.2 序列测定及DNA序列分析

1.2.2.1 序列测定

1.2.2.2 测序结果的FramePlot分析和序列同源性比较

1.2.3 克隆基因功能的初步分析

1.2.3.1 阻断载体的构建

1.2.3.2 单交换基因阻断菌株的获得

1.2.3.3 阻断变株的Southern blot杂交验证

1.2.3.4 阻断变株的发酵组分分析

2.E片段的初步研究

2.1 BamHI 9.0kb-E片段亚克隆和酶切图谱分析

2.2 克隆片段功能的初步研究

2.2.1 E片段阻断载体的构建及酶切鉴定

2.2.2 基因阻断菌株的获得

2.2.3 阻断变株的发酵组分分析

3.50kb连锁区域与已报道的13.8kb妥布霉素生物合成基因簇的位置关系

4.讨论

结论

参考文献

致谢

附录

发布时间: 2006-11-27

参考文献

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