植物和内生菌提取物抗耐药细菌的筛选与活性成分研究

论文题目: 植物和内生菌提取物抗耐药细菌的筛选与活性成分研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物医学工程

作者: 杨再昌

导师: 王伯初,杨小生

关键词: 内生菌,多糖,挥发油,耐药细菌,外排泵,内酰胺酶

文献来源: 重庆大学

发表年度: 2005

论文摘要: 近年来,细菌对各类抗菌药物产生耐药性发展迅速,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)、多重耐药性结核杆菌尤其是耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现,给临床治疗造成了困难。由于现有药物较难控制耐药菌感染,研制抗耐药菌药物已经成为药学领域中的研究热点。本实验的目的是建立植物和内生菌提取物库,以细菌、细菌外排泵及β-内酰胺酶为靶点,筛选对耐药菌有抗菌作用的样本,通过活性跟踪分离,得到活性单体或组分,为研制新的抗耐药菌药物奠定基础。植物及植物内生菌的次生代谢产物是一个庞大的化合物库,是发现新的抗菌物质的天然资源。本实验的样本库由植物及植物内生菌的提取物组成,共300个个样本。以临床分离的金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌耐药菌株为靶点,采用Kirby-Barer纸片法及药基法进行筛选,发现橙色串珠霉(M.erythraea Sh.Et Dodge)的菌丝提取物具有较强的抑菌活性,用TLC进行活性跟踪、柱色谱分离,得到具有抗菌活性的单体化合物1,根据化合物1的1H、13C NMR谱及高分辨质谱,鉴定为21,25-二甲基-24-乙基-8,15,22-三烯-3β-甾醇。检测了化合物1对9株细菌的MIC浓度,在8-128μg/ml之间,对G+菌的抑制效果强,为杀菌作用,对G-菌的抑制效果较弱,对金黄色葡萄球菌ATCC25923及耐药株的MIC、MBC浓度相同,说明敏感株和耐药株存在共同靶位。用金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌耐药菌株感染小鼠,化合物1的保护率在70-100%之间,呈明显的量-效关系。化合物1属于甾醇类化合物,毒性低(化疗指数﹥7),尚无类似结构的抗菌药物上市,因此,可作为抗菌先导物进行结构修饰,值得进一步研究。将抗菌药物泵出胞外是细菌广泛存在的耐药机制,抑制细菌外排泵(efflux pump),可以增加细菌胞内药物浓度,使耐药菌恢复对原抗菌药物的敏感性。以小蘖碱为细菌外排泵底物,建立细菌外排泵抑制剂双平板筛选模型,从样本库中筛选出白前、牡丹皮乙醇提取物及橙色串珠霉菌液提取物,经活性跟踪分离,得到化合物2、3、4三个抑制细菌外派泵的活性单体,通过波谱解析,其结构鉴定为:2,4-二羟基苯乙酮(化合物2)、5,7-二羟基-4′-羟甲基异黄酮(化合物3)、2-羟基-4-甲氧基苯乙酮(化合物4)。体外试验表明,三种化合物均能提高耐药菌对环丙沙星、红霉素、四环素、小蘖碱的敏感性。体内抗耐药菌感染试验发现,化合物2可能存在神经毒性,化合物4可以抑制动物细胞外排泵,不是细菌外排泵专一性抑制

论文目录:

中文摘要

英文摘要

1 绪论

1.1 研究背景

1.2 抗耐药菌药物的研究策略

1.2.1 随机筛选具有新结构、新靶位的抗菌化合物

1.2.2 针对细菌耐药机制，保护或增强抗菌药物的抗菌活性

1.2.3 依靠宿主免疫功能清除体内细菌

1.3 论文设计

1.3.1 论文设计的思想

1.3.2 论文的研究内容

1.3.3 技术路线

1.3.4 预期结果

2 抗耐药菌药物筛选样本库的建立

2.1 概述

2.2 植物提取物样本库

2.2.1 植物的种类、来源

2.2.2 提取物的制备

2.3 植物内生菌提取物样本库

2.3.1 植物内生菌的分离、培养

2.3.2 内生菌提取物的制备

3 基于细胞的抗耐药菌天然产物的筛选及活性跟踪分离

3.1 概述

3.2 筛选菌株

3.2.1 菌株来源及药敏试验

3.2.2 药敏试验方法

3.3 筛选方法及筛选结果

3.3.1 筛选方法

3.3.2 筛选结果

3.4 橙色串珠霉（M.ERYTHRAEA）次生代谢产物抗菌活性单体的跟踪分离

3.4.1 菌株鉴定及粗提物的TLC 活性跟踪

3.4.2 活性单体的分离、结构鉴定及抗菌活性

3.4.3 活性单体的体内抗耐药菌感染试验

4 细菌外排泵抑制剂的筛选及活性跟踪分离

4.1 概述

4.2 筛选方法的建立及筛选结果

4.2.1 筛选方法

4.2.2 筛选结果

4.3 2,4-二羟基苯乙酮的分离及鉴定

4.3.1 白前提取物外排泵抑制剂的活性跟踪分离

4.3.2 活性单体的结构鉴定

4.4 5,7 -二羟基-4′-羟甲基异黄酮的分离及鉴定

4.4.1 橙色串珠霉发酵液外排泵抑制剂的活性跟踪分离

4.4.2 活性单体的结构鉴定

4.5 2-羟基-4-甲基苯乙酮的分离及鉴定

4.5.1 牡丹皮外排泵抑制剂的活性跟踪分离

4.5.2 活性单体的结构鉴定

4.6 三种化合物对细菌外排泵的抑制作用

4.6.1 对细菌外排小蘖碱的抑制作用

4.6.2 与抗菌药物的体外协同抗菌作用

4.6.3 与环丙沙星的体内协同抗感染作用

5 β-内酰胺酶抑制剂的筛选及活性跟踪分离

5.1 概述

5.2 β-内酰胺酶的分离纯化

5.2.1 产β-内酰胺酶菌株的鉴别

5.2.2 β-内酰胺酶的分离纯化及活力测定

5.2.3 酶促反应的最适pH 及温度

5.2.4 酶的催化底物谱测定

5.2.5 β-内酰胺酶的分类

5.3 STARCH-IODINE 平板新筛选方法的建立

5.3.1 原理

5.3.2 Starch-iodine 平板筛选β-内酰胺酶抑制剂

5.3.3 讨论

5.4 β-内酰胺酶抑制剂的筛选

5.4.1 小分子样本库

5.4.2 筛选结果

5.4.3 SM14,16 与甲氧西林的体外联合抗菌实验

5.4.4 SM14,16 与甲氧西林的联合抗感染试验

5.5 北五味子的活性跟踪分离

5.5.1 北五味子β-内酰胺酶抑制剂的活性跟踪分离

5.5.2 活性单体的结构鉴定

5.6 杨柳树皮的活性跟踪分离

5.6.1 杨柳树皮β-内酰胺酶抑制剂的活性跟踪分离

5.6.2 活性单体的结构鉴定

5.7 酒石酸、水杨酸抑制β-内酰胺酶的实验研究

5.7.1 酒石酸、水杨酸对β-内酰胺酶的抑制活性

5.7.2 酒石酸、水杨酸与β-内酰胺类抗菌素的联合抗菌作用

5.7.3 酒石酸、水杨酸与甲氧西林的联合抗感染作用

5.8 β-内酰胺酶抑制剂构效关系浅析

5.8.1 材料与方法

5.8.2 结果

5.8.3 讨论

6 鸡屎藤、白前粗多糖的体内抗菌试验

6.1 概述

6.2 粗多糖的制备

6.2.1 粗多糖的提取

6.2.2 粗多糖的检测

6.3 粗多糖对细菌感染小鼠的药效及药理研究

6.3.1 两种植物粗多糖对细菌感染小鼠的保护率

6.3.2 两种植物粗多糖对细菌感染小鼠免疫功能的影响

7 两种植物挥发油的抗感染试验

7.1 概述

7.2 油茶树、柳叶白前挥发油的GC-MS 分析

7.2.1 材料与方法

7.2.2 结果

7.3 油茶树挥发油的抗菌活性

7.4 柳叶白前挥发油的抗病毒作用

7.4.1 材料与方法

7.4.2 结果

7.4.3 讨论

8 结论

8.1 全文主要结论

8.2 本课题的创新点

8.3 后续工作建议

致谢

参考文献

附录A 作者在攻读博士学位期间参与科研项目及发表的论文

附录B 文献综述

附录C 化合物图谱

独创性声明

学位论文版权使用授权书

发布时间: 2006-12-05

参考文献

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