人羊膜上皮细胞横向分化为肝细胞样细胞及脾内移植的初步研究

论文摘要

在胚胎发育过程中,肝脏的整个发育过程是一个涉及多基因、多环节、多途径的网络调控过程。1965年Farber的研究揭开了对于肝细胞研究的新篇章,他首次提出在肝内存在小上皮细胞,即卵圆细胞。他的发现推动了肝再生及肝细胞肝癌发病机制的深入研究。目前认为肝干细胞（hepaticstem cell,HSC）来源于前肠内胚层,在胚胎发育过程中以未成熟的肝细胞的形式存在,其形态与胆管上皮细胞相似,其生化特征类似于胚胎干细胞。20世纪末,大量研究表明,成体干细胞可以跨越胚层限制分化为肝细胞。美国科学家近年宣布,他们在羊水中发现了和胚胎干细胞一样有效的干细胞,并在实验室中使这种干细胞分化成肌肉、骨头、脂肪、血管、神经和肝脏细胞。和胚胎干细胞相比,这种干细胞更容易分化成各种组织,且不会形成一种名为畸胎瘤的良性肿瘤。来源于人废弃胎盘的羊膜上皮细胞（human amnioticepithelial cells,hAECs）是这样一类极具研究潜力的细胞。目前国内外这方面的研究尚处于起步阶段。本课题对人羊膜上皮细胞完成了体外检测和鉴定,对其向肝细胞样细胞体外分化的条件进行了摸索和优化,在成功诱导生成肝细胞样细胞的基础上,将诱导获得的肝细胞样细胞移植入裸小鼠体内,检测了诱导获得的肝细胞样细胞是否具有生物学功能。本研究分为3个部目的:建立人羊膜上皮细胞的体外分离方法及培养体系,检测人羊膜上皮细胞的生物学特性,检测人羊膜上皮细胞的AAV-EGFP感染效率。方法:使用胰蛋白酶从人羊膜上消化人羊膜上皮细胞进行培养,细胞免疫荧光检测胚胎干细胞表面SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4和TRA-1-60、TRA-1-81标记;RT-PCR检测全能性相关基因TERF、THY1、LEFTYA、Rex-1、Sox-2、Oct-4和nanog等的表达;腺相关病毒感染检测人羊膜上皮细胞的AAV-EGFP感染效率。结果:人羊膜上皮细胞表达SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81等胚胎干细胞的特异性标记;表达TERF1、THY、EFTYA、Rex-1、SOX2、Oct-4和Nanog等全能性相关基因;人羊膜上皮细胞的AAV-GFP感染效率在病毒浓度为10-3pfu/ml时可达58.2%±1.3%。结论:建立了hAECs的细胞分离方法及适合hAECs生长和增殖的体外培养体系;hAECs具干细胞特征;体外培养的hAECs细胞可以被AAV-GFP感染,并表达GFP,且表达效率达50%以上。目的:研究Dex,HGF,IGF等细胞因子联合使用的诱导体系对hAECs向肝细胞样（hepatocyte-like）细胞诱导分化的影响。方法:采用Dex,HGF,IGF等细胞因子联合使用方法诱导培养hAECs向肝细胞样细胞分化,诱导周期为两周。诱导过程中采用RT-PCR鉴定细胞ALB、CYP1A1、CYP1A2、IGFR、c-met等肝细胞相关关键功能基因的表达和HNF3、HNF4和C/EBPa三种转录因子的表达。流式细胞术分析集落细胞表面标记ALB、AFP和CK18的时程变化;为了优化诱导体系,检测了Dex、HGF、IGF等细胞因子的剂量依赖性;比较不同代数的hAECs在诱导向肝细胞样细胞分化的ALB基因表达情况。结果:在诱导两周后的hAECs中可以检测到ALB、CYP1A1、CYP1A2、IGFR、c-met等肝细胞相关关键功能基因的表达,且这些功能基因的表达呈现逐渐递增的趋势。提示hAECs可能已经被成功诱导为肝细胞样细胞。诱导前的hAECs表达HNF1（一种肝细胞转录因子）,不表达HNF3、HNF4和C/EBPa;而诱导后的hAECs不仅可以表达HNF1,还可以表达HNF3,HNF4和C/EBPa,并且HNF1的表达在诱导前后的hAECs中也有所不同,诱导后的hAECs中HNF1的表达水平明显高于没有经过诱导的hAECs。细胞表面标记检测发现:诱导6天时,hAECs主要表达AFP+,约为15.1±2.1%;随着诱导时间的延长,10天时hAECs表达AFP+/ALB+,约为6.5±1.4%;而诱导14天时,hAECs基本上只表达ALB+,为13.9±2.3%。诱导10天时的hAECs开始表达ALB+/CKl8+;约为2.5±1.4%;诱导14天时,细胞依然表达ALB+/CK18+,且这种双阳性的细胞量有明显增加,为18.9±3.1%;同时CK18+细胞数并没有明显减少,诱导10天时,CK18+细胞数为16.1±1.2%;诱导14天时,CK18+细胞数为21.3±4.6%。提示,诱导过程中的hAECs随着诱导时间的延长有一个逐渐成熟的过程。剂量依赖性实验结果显示,IGF、HGF均存在剂量依赖性,而Dex的剂量依赖性实验结果不具有统计学意义,认为不存在剂量依赖性。对不同代数的hAECs在诱导向肝细胞样细胞分化的ALB基因表达情况进行比较,结果显示,传代三代的hAECs诱导后均能表达ALB基因,且在表达强度上没有明显区别结论:hAECs确实可以在体外向肝细胞样细胞进行诱导分化,并能被成功诱导分化为有功能的肝细胞样细胞;hAECs向肝细胞样细胞的诱导过程中,对于HGF和IGF具有剂量依赖性,而对于Dex的这种剂量依赖性并不明显;传代三代内的hAECs诱导后,在肝细胞样细胞特异性功能基因ALB的表达上没有明显区别。目的:观察人羊膜上皮细胞（hAECs）在肝脏受损裸鼠脾内移植后是否具有肝细胞样功能的表达并探讨其治疗肝功能损伤的可行性。方法: 40只裸小鼠,随机分为三组,A组:20只,行2/3肝叶切除后,自脾下极移植5×106绿色荧光蛋白标记的hAECs;B组:10只,不行肝叶切除,自脾下极移植5×106绿色荧光蛋白标记的hAECs;C组:10只,行2/3肝叶切除后,自脾下极注射生理盐水0.2 mL。荧光显微镜hAECs体内示踪并观察其是否表达肝细胞特异性蛋白;术后2周A、B组各10只裸小鼠采血定量检测裸鼠血中人白蛋白及肝功能,术后4周A组另10只及C组10只裸小鼠做以上相同检测。结果: A组镜下肝脏和脾脏组织中均发现绿色荧光信号的hAECs,大部分表达人白蛋白;B、C组镜下均未见绿色荧光细胞。A组血中可检测到人白蛋白且术后4周明显高于术后2（3.9±1.34vs0.37±0.14,P<0.01）;术后4周A组肝功能（ALB、ALT、AST）明显优于C组（p<0.05）,A组肝功能术后4周亦优于术后2周（p＜0.05）。结论:肝损伤可以有效诱导hAECs向肝迁移增殖,大部分hAECs在肝细胞损伤的微环境下有肝细胞样功能表达,hAECs移植可以在一定程度上修复受损肝功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 人羊膜上皮细胞的分离培养及其干细胞生物学特征的鉴定人胚胎干细胞自发向造血细胞分化的研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 分子生物学试剂
• 1.2 细胞生物学试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 标本来源
• 1.5 研究方法
• 1.5.1 人羊膜上皮细胞的分离及培养
• 1.5.2 人羊膜上皮细胞干细胞特征的鉴定
• 1.5.3 腺相关病毒感染人羊膜上皮细胞
• 1.6 统计学方法
• 2. 结果
• 2.1 人羊膜上皮细胞的培养
• 2.2 人羊膜上皮细胞细胞生物学特性的鉴定
• 2.3 人羊膜上皮细胞腺相关病毒的感染
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 彩色附图
• 第二章 人羊膜上皮细胞向肝脏细胞样细胞诱导分化的初步研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 细胞培养
• 1.4 体外诱导人羊膜上皮细胞向肝脏细胞样细胞分化
• 1.5 半定量PCR检测功能基因随时间改变而变化的趋势
• 1.6 流式细胞技术检测分化效率对诱导分化体系进行优化
• 1.7 原代及体外传代两代的人羊膜上皮细胞诱导后ALB基因表达的比较
• 1.8 统计学方法
• 2. 结果
• 2.1 细胞形态
• 2.2 肝细胞样细胞相关转录因子及功能基因的表达
• 2.3 诱导后的人羊膜上皮细胞表达AFP,ALB,CK18等肝细胞特异性的细胞表面标记
• 2.4 诱导过程中肝细胞ablumin,CYP3A4,CYP1A2等功能基因随诱导天数的增加其表达逐渐增强
• 2.5 诱导中的hEACs在不同诱导时间表达AFP,ALB,CK18等肝细胞特异性的细胞表面标
• 2.6 诱导过样中的Dex,HGF,IGF等细胞因子的剂量依赖性作用
• 2.7 不同代数体外培养的人羊膜上皮细胞诱导后均表达albumin基因
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 彩色附图
• 第三章 人羊膜上皮细胞脾移植治疗肝损伤裸小鼠的实验研究
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 细胞培养及AAV-GFP感染效率检测
• 1.4 体外诱导hAECs细胞向肝细胞样细胞分化
• 1.5 肝切除动物模型的制备及移植
• 1.6 实验分组
• 1.7 移植效果检测
• 1.8 移植细胞体内示踪
• 1.9 统计分析
• 2. 结果
• 2.1 实验动物存活情况
• 2.2 标本的大体观察
• 2.3 组织学观察
• 2.4 免疫荧光染色
• 2.5 血清肝功能检测
• 2.6 裸鼠血中人白蛋白检测
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 彩色附图
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读博士期间发表的论文目录
• 个人简历