论文摘要
促性腺激素释放激素（gonadotrophin releasing hormone,GnRH）是下丘脑分泌的十肽激素,其生理功能是调节垂体前叶促性腺激素的分泌。近年来的研究发现在乳腺、卵巢、子宫内膜、前列腺、胰腺、结肠、肺、肝脏的肿瘤细胞上有GnRH受体分布。GnRH及其类似物可抑制这些肿瘤细胞生长,它们的抗肿瘤效应是通过垂体及垂体外的机制实现的。缺氧是实体肿瘤的特征性病理改变。氧依赖性降解区域（oxygen-dependent degradation domain,ODD）是缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）上控制其稳定的关键区域,通过其核心脯氨酸的羟化,在常氧状态时使HIF-1α被蛋白酶降解。p53是细胞内重要的肿瘤抑制因子,它可以通过诱导肿瘤细胞凋亡和诱发肿瘤细胞发生细胞周期阻滞而产生抗肿瘤作用。研究表明人类50%以上的肿瘤的发生都与细胞内P53基因突变、缺失有关,因此p53一直是近年来抗肿瘤研究的热点。本课题旨在以p53为肿瘤治疗的效应分子,通过GnRH与其受体特异结合介导蛋白进入相应的肿瘤细胞,应用ODD减轻p53对正常组织的损伤,增强蛋白对实体肿瘤的靶向作用,构建pET28a-GnRH-P53（pET28a-GP）、pET28a-GnRH-ODD-P53（pET28a-GOP）、pET28a-GnRHⅢ-P53（pET28a-G3P）、pET28a-GnRHⅢ-ODD-P53（pET28a-G3OP）、pET28a-GnRH-ODD557-574aa-P53 （pET28a-GSOP）、pET28a-GnRHⅢ-ODD557-574aa-P53（pET28a-G3SOP）原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导重组质粒表达相应的融合蛋白,将表达后菌体超声处理后离心,收集包涵体后进行变性、复性、纯化,从而得到具有生物学功能的融合蛋白。在细胞和动物水平研究融合蛋白的抗肿瘤作用。具体方法为:应用MTT法测定融合蛋白对肿瘤细胞生长的抑制作用;细胞免疫化学法、细胞免疫荧光法测定融合蛋白在细胞中的定位;应用流式细胞术测定融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡及其诱发肿瘤细胞周期阻滞;Western blot检测融合蛋白抗肿瘤的可能机制。以H1299细胞建立BALB/c裸鼠荷瘤模型,将实验动物随机分为C （正常对照组）,TC （肿瘤对照组）,GP（GnRH-p53）,GOP（GnRH-ODD-p53）,G3P （GnRHⅢ-p53）,G3OP（GnRHⅢ-ODD- p53）六组,以5mg/kg/天的剂量腹腔给药（对照组动物给予等量的生理盐水）,测定融合蛋白对模型鼠的抗肿瘤作用,同时对模型鼠血浆生化指标进行测定初步判断融合蛋白对动物的毒副作用。本课题的实验结果:①构建了pET28a-GnRH-P53系列重组质粒载体,将其转入大肠杆菌BL21后成功表达了相应的融合蛋白。②经细胞免疫荧光法、细胞免疫化学法、Western blot检测表明融合蛋白可以进入GnRH-R表达阳性的H1299细胞、DU145细胞、T47D细胞、MDA-MB-231细胞以及SW480细胞。③经MTT法测定表明GP、GSOP、G3P、G3SOP在常氧和缺氧条件下均可以抑制H1299细胞的生长,并且这种作用具有剂量依赖性,即随着蛋白浓度的增加其抑制H1299细胞生长作用增强;GOP和G3OP在缺氧条件下对H1299细胞的生长抑制作用比其在常氧条件下的作用明显;融合蛋白对DU145细胞、T47D细胞、MDA-MB-231细胞以及SW480细胞也具有增殖抑制作用;融合蛋白对H1299细胞的增殖抑制作用强于相同剂量的GnRH类似物亮丙瑞林和G662。④流式细胞术测定融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡表明,融合蛋白在常氧状态下可以增加H1299细胞早期凋亡的百分率,其作用在48h最强,而与PBS对照相比,G3OP在给药24h时可显著诱导H1299细胞发生早期凋亡;在缺氧状态下,给药24h,与RPMI1640空白培养基对照相比较,各融合蛋白均可显著诱导H1299细胞发生早期凋亡; GOP和G3OP在缺氧状态下的作用比其在常氧状态下诱导细胞凋亡作用明显增强。⑤在常氧和缺氧状态下,各融合蛋白可以诱导H1299细胞G0/G1期细胞比例增加,而处于S期细胞的百分数减少,DNA合成受到抑制,即发生细胞G1期阻滞。⑥经Western blot检测,融合蛋白可以上调H1299细胞中的Caspase-3蛋白、p21蛋白表达水平,推测融合蛋白抑制H1299细胞生长的机制与活化Caspase-3蛋白诱导细胞凋亡及上调p21蛋白表达促进细胞发生G1期阻滞相关。⑦测量、计算各组实验动物瘤体体积发现,与TC组比较GP抑制瘤体生长作用十分显著（p<0.01）,GOP、G3P、G3OP抑瘤作用较明显（p<0.05）。⑧免疫组化方法检测荷瘤模型小鼠肝脏和肿瘤切片,发现p53蛋白主要分布于肿瘤组织中,而且给药组动物肿瘤组织切片中Caspase-3蛋白、p21蛋白、PUMA蛋白的含量较对照组高,表明融合蛋白对荷瘤模型小鼠的抗肿瘤作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡和发生细胞周期阻滞而实现的。⑨动物血浆生化指标测定结果表明,融合蛋白对动物的肝、肾功能几乎没有影响。由以上结果得出如下结论:在细胞和动物整体水平上,融合蛋白GP、GOP、G3P、G3OP具有抑制肿瘤生长作用,其抗肿瘤作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡和发生细胞周期阻滞而实现的。GP等融合蛋白有望开发成为新型的抗肿瘤药物。
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标签：促性腺激素释放激素论文; 氧依赖性降解区域论文; 肿瘤治疗论文; 凋亡论文;