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中棉所36花发育均一化cDNA文库构建及EST分析

2020-12-07阅读(930)

中棉所36花发育均一化cDNA文库构建及EST分析

论文摘要

以cDNA文库为基础的ESTs（Expressed Sequence Tags,表达序列标签）技术是一种快速地进行基因功能分析及发现新基因的有效方法。为了开展识别和分离开花相关基因研究,本文构建了中棉所36花发育期均一化cDNA文库,并以该文库为材料进行大规模的3’端EST测序和生物信息学分析。本研究获得的主要结果如下:1.采用本实验改良的CTAB法从中36花发育各种形态花器官中提取总RNA,混合后分离纯化富含PolyA的mRNA,经反转录酶反转录合成双链cDNA,利用DSN法对其进行了均一化。均一化之后,通过过柱回收法筛选出其中大于500bp的片段与载体pDNR-LIB连接,最后用电转化法转化宿主菌ElectroMAXDH10B,构建了中棉所36花发育期均一化cDNA初级cDNA文库。经质量检测,高丰度基因被降低,而中丰度和低丰度基因得到了富集,说明均一化效果比较好。初级文库的库容为1.7×106个/mL,符合高质量文库的要求。文库的重组率为100%,且插入片段的长度在0.5～3.0 kb之间,说明文库是完整、有效的,可以用于大规模EST序列测定及数据分析。2.从中棉所36花发育期均一化cDNA质粒文库中随机选取3421个克隆进行测序,经Phrad软件进行编辑后,获得长度大于100bp的有效序列为3175条,其序列的平均长度为541bp。3.利用Phrap软件对中36花发育期3175条有效EST序列进行片段重叠群分析和拼接后共获得2906个独立基因,其中包括233个片段重叠群和2673个独立的ESTs。4.在3175条序列中,84.19%的序列是单一序列,约15.65%的序列重复次数在2-5次,仅有1条序列的重复次数是5次。用BLAST方法分析这条高拷贝序列,发现它与核苷酸数据库中的EST有很高的同源性,但其基因产物尚不清楚。同时,文库中用来衡量平衡效果的组成型表达基因（如肌动蛋白（actin）和核糖体蛋白（ribosomal protein）基因的各类亚基）的水平都已经降到3个拷贝以下。表明均一化后高丰度基因所占比例下降,中低丰度基因所占比例增大。表明文库的均一化效果显著。5.所有有效序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对,有31.42%（913/2906）的序列显示了与己知序列高度的同源性;而与蛋白质数据库进行比对时有26.52%（763/2906）的序列显示了与已知序列的同源性。通过表达序列标签（EST）研究中棉所36花发育期基因表达,发现9条EST与花发育有关MADS-box基因存在高度同源性。6.根据SWISSPORT数据库注释的ACCESSION,将独立基因以Gene Ontology进行功能分类。763个具有同源性匹配的序列（被注释）的基因中,按照GO的分子功能、生物过程和细胞组分分三个不同分类角度分类,把通过BlastX比对获得花发育期有功能描述基因（包括功能确定的及推测功能的）分为16类,根据所参与的细胞过程将其分为16大类:代谢相关基因（23.98%）、翻译相关基因（20.18%）、翻译后剪接相关基因（15.73%）、一般功能预测基因（11.93%）、能量代谢相关基因（6.82%）、转录相关基因（4.06%）、信号转导相关基因（3.67%）、未知功能基因（2.75%）、次生代谢相关基因（2.62%）、核染色质结构相关基因（2.36%）、细胞结构相关基因（1.57%）、细胞内运输相关基因（1.44%）、复制相关基因（1.31%）、细胞骨架相关基因（0.92%）、RNA处理相关基因（0.39%）、细胞抗性及防御相关基因（0.26%）。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略表
  • 第一章 文献综述
  • 1.植物花发育相关基因的研究进展
  • 1.1 植物成花机理
  • 1.1.1 成花诱导过程（Induction process）
  • 1.1.2 花序分生组织的形成
  • 1.1.3 花分生组织的形成
  • 1.1.4 花器官原基的形成
  • 1.2 棉花花发育相关基因研究
  • 2.基因文库
  • 2.1 基因组文库和cDNA文库
  • 2.2 构建cDNA文库的方法
  • 2.2.1 cDNA文库的构建
  • 2.2.2 均一化cDNA文库的构建
  • 2.2.3 复性式均一化技术
  • 2.2.3.1 Carninci法
  • 2.2.3.2 DSN法
  • 2.2.4 与基因组饱和杂交的方法
  • 2.3 棉花cDNA文库的构建和应用
  • 2.4 cDNA文库的缺点
  • 3 EST技术及其应用
  • 3.1 EST及其研究概况
  • 3.2 EST技术的原理和方法
  • 3.3 EST的应用
  • 3.3.1 构建遗传学图谱
  • 3.3.2 分离与鉴定新基因
  • 3.3.3 基因差异表达的研究
  • 3.3.4 比较基因组学研究
  • 3.3.5 用于制备DNA芯片
  • 3.4 棉花EST
  • 4.本研究的目的意义
  • 第二章 中棉所36花发育期均一化CDNA文库的构建
  • 1 实验材料与试剂
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 化学试剂、酶及试剂盒
  • 2 实验方法
  • 2.1 总RNA的提取
  • 2.2 mRNA的分离纯化
  • 2.3 cDNA的合成
  • 2.3.1 合成cDNA第一链
  • 2.3.2 cDNA扩增（Long-distancePCR,LD-PCR）
  • 2.4 cDNA的均一化
  • 2.4.1 特异降解双链DNA酶（DSN）的稀释
  • 2.4.2 DSN活性检测
  • 2.4.3 准备用于均一化的双链cDNA
  • 2.4.4 杂交
  • 2.4.5 DSN处理
  • 2.4.6 对DSN处理的样品进行第1次PCR扩增
  • 2.4.7 对DSN处理的样品进行第2次PCR扩增
  • 2.5 蛋白酶处理
  • 2.6 sfi Ⅰ酶处理
  • 2.7 用Chroma SPIN—400将cDNA按分子大小分级分部
  • 2.8 处理后dscDNA与载体pDNR-LIB连接
  • 2.9 连接产物转化（以下操作均在无菌环境下进行）
  • 2.10 均一化文库滴度检测
  • 2.11 均一化文库插入片断长度检测
  • 2.12 cDNA均一化效果分析
  • 2.12.1 虚拟Northern blot（Virtual Northern blot）
  • 3 实验结果与分析
  • 3.1 总RNA的提取
  • 3.2 mRNA的分离
  • 3.3 mRNA反转录成全长cDNA
  • 3.4 均一化
  • 3.4.1 全长cDNA的均一化
  • 3.4.2 均一化cDNA的第二次扩增
  • 3.5 用Chroma SPIN—400将cDNA按分子大小分级分部
  • 3.6 克隆数目和重组率的鉴定
  • 3.7 插入片断长度的检测
  • 3.8 均一化cDNA文库的均一化效果分析
  • 4 讨论
  • 4.1 取样
  • 4.2 棉花总RNA的提取
  • 4.3 mRNA的纯化及反转录
  • 4.4 均一化全长cDNA文库
  • 4.5 DSN法与其它均一化方法的比较
  • 第三章 中棉所36花发育期表达序列标签（EST）分析
  • 1 分析材料
  • 2 生物信息学分析
  • 2.1 序列拼接
  • 2.2 基因注释及功能分类
  • 3 结果与分析
  • 3.1 有效EST序列的获得
  • 3.2 EST序列拼接分析
  • 3.3 基因表达频率与均一化分析
  • 3.4 基因注释及功能分类
  • 4 讨论
  • 4.1 Blastn与Blastx比对结果的差异
  • 4.2 ESTs与数据库同源性比较
  • 第四章 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 相关论文文献

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