川芎嗪对缺氧复氧大鼠海马神经元的保护作用及机制研究

论文摘要

围术期脑缺血再灌注损伤一直是临床麻醉与复苏所关注的问题。据国外报道,成人体外循环下心内直视手术后第一周内,细微的神经功能异常或精神损伤发生率可高达53%,6个月后部分病人得到改善,但24%的病人仍遗留精神行为减退,其中42%病人甚至持续5年之久。缺血再灌注中神经细胞损伤是一个多因素、多环节、多途径的过程,其分子机制迄今尚未完全阐明。临床中川芎嗪常用于缺血性脑血管疾病及其后遗症的治疗,然而,我们对其作用机制尚有不少分歧、争议。本研究拟在体外原代培养大鼠海马神经元细胞的基础上,探讨川芎嗪对缺氧／复氧大鼠海马神经元的影响,试图通过本研究,从细胞、分子水平上阐明川芎嗪脑保护作用机制,为川芎嗪脑保护的方法在临床上的应用开创新的思路,提供理论依据,减轻社会和经济负担。研究目的：1.观察川芎嗪对体外培养大鼠海马神经元形态和细胞活力的影响,初步了解川芎嗪对海马神经细胞的干预作用。2.观察川芎嗪对缺氧／复氧大鼠海马神经元的保护作用,并探讨其作用机理。研究方法：1.体外培养大鼠海马神经元,培养第7-9天,光学显微镜和免疫细胞化学染色鉴定神经元。2.分别将含川芎嗪30、60、90、200、800、1000μg／ml的培养液加入培养至7-9天的大鼠海马神经元中,与海马神经元共培养24小时,观察川芎嗪对其形态学和细胞活力的影响。3.实验分组及缺氧／复氧模型的建立以培养7-9天的胎鼠海马神经元为研究对象,随机分为5组：L组（TMP低浓度组60ug／ml）,M组（TMP中浓度组200ug／ml）,H组（TMP高浓度组800ug／ml）,C组（对照组0ug／ml）,N组（正常组）。除正常组外分别加入相应浓度的川芎嗪,作用1小时后放入90%N2+10%CO2培养箱中作用2小时诱导缺氧,然后放入5%CO2培养箱中复氧。4.培养7-9天的胎鼠海马神经元缺氧／复氧损伤后,MTT法检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态学变化,透射电镜观察细胞超微结构变化,分光光度计检测培养上清中MDA、SOD、LDH的含量,流式细胞仪检测神经元凋亡率,免疫细胞化学检测即早基因C-fos蛋白和热休克蛋白（HSP70）的表达。研究结果：1.相差显微镜下培养至7-9天的大鼠海马神经元细胞胞体呈锥形或多角形,突起主干和分支明显延长并增粗,有明显光晕,折光性强,富有立体感,形成稠密的网络结构,细胞免疫组化结构显示,大部分细胞可见神经元烯醇酶（neuron specific enolase,NSE）免疫阳性颗粒位于神经细胞核周质及核突起中（呈棕黄色）,细胞核不染色,为一圆形或椭圆形淡然区,此类细胞为神经元；少量细胞呈弱阳性,该类细胞为胶质细胞。透射电镜可见其神经元体积较大,细胞核、细胞质均较大,呈浅灰色着色,染色质分布均匀,核膜双层结构完整,线粒体、溶酶体、内质网等细胞器较丰富。2.川芎嗪与与大鼠海马神经元共培养24h,与正常对照组（0μg／ml）相比,30μg／ml、60μg／ml、90μg／ml、800μg／ml川芎嗪组形态学上无明显变化；200μg／ml川芎嗪组神经元胞体较大,突起密集；1000μg／ml川芎嗪细胞变圆、皱缩,折光性下降,部分突起收缩。3.缺氧／复氧损伤后,海马神经细胞折光性下降,部分细胞变圆、皱缩、脱落,裂解成碎片,透射电镜显示胞核呈圆形,核膜光滑,染色质边集,线粒体肿胀、部分内质网扩张,或线粒体嵴断裂、模糊或消失,粗面内质网数量减少、排列紊乱。60、200、800ug／ml川芎嗪预给药1h,能不同程度的减轻缺氧／复氧对大鼠海马神经元的损伤,光镜下细胞形态无明显改变,透射电镜下可见200μg／ml组除少量染色质边聚、内质网轻度扩张、线粒体轻微肿胀外,余与正常的海马神经元细胞无明显差异。4.缺氧／复氧损伤后川芎嗪60μg／ml、200μg／ml、800μg／ml预给药组细胞活力、MDA、SOD、LDH的含量分别为（0.59±0.09、0.72±0.04、0.60±0.07）、（3.75±0.26、2.43±0.86、3.45±0.47）nmol／ml、（30.76±4.28、41.53±3.28、33.54±5.07）U／ml、（623.71±102.83、276.63±75.59、537.80±109.18）U／L,与单纯缺氧／复氧有显著性差异（P＜0.05）。川芎嗪200μg／ml组较60μg／ml、800μg／ml组差异亦有显著性。5.与单纯缺氧／复氧组比较,川芎嗪60μg／ml、200μg／ml、800μg／ml预给药均可不同程度降低海马神经细胞的凋亡率（P＜0.01）、降低C-fos蛋白的表达（P＜0.01）、促进HSP70蛋白的表达（P＜0.05）。川芎嗪200μg／ml组差异最为显著。研究结论：1.本实验建立的胎鼠海马神经元培养方法,可得到纯度较高的神经元,为揭示神经元、神经网络超微结构及神经元生理、生化和病理等方面的复杂变化和研究神经药理提供了便利。2.一定浓度的川芎嗪对正常培养的大鼠海马神经元有促进作用,其神经元胞体较大,突起密集。3.川芎嗪60μg／ml、200μg／ml、800μg／ml预给药均可不同程度降低缺氧／复氧诱导海马神经细胞的凋亡和坏死,抑制LDH的漏出、减少MDA的产生、促进SOD的生成；同时可抑制即早基因C-fos蛋白的表达,促进热休克蛋白（HSP70）的表达。该作用具有剂量相关性,高、中、低三种浓度的川芎嗪均有保护作用,200μg／ml浓度的川芎嗪保护作用最显著。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 文献综述与立项依据
• 第一节 脑缺血与再灌注损伤
• 第二节 缺血性脑损伤治疗现状
• 第三节 川芎嗪与脑保护
• 第四节 立论依据及研究意义
• 第二部分 实验研究
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 第三节 实验结果
• 第四节 讨论
• 结语与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间成果
• 致谢