杆状病毒泛素、多角体基因启动子分析及表达系统的应用

论文摘要

本文围绕杆状病毒泛素（ubiquitin,ubi）基因启动子结构及功能元件、杆状病毒IE1及hr3对晚期ubi和极晚期polh启动子的作用、参与杆状病毒晚期基因泛素表达的病毒因子、耐高温β-glucosidase在家蚕中的表达及纯化等方面作了一定的研究。 （1）杆状病毒ubiquitin基因启动子结构及功能元件的分析 克隆的启动子与BmNPV T3株及AcMNPV C6株ubi启动子的同源性分别为98.9%、99.5%,二者之间的同源性为92.8%。该序列中具有两个杆状病毒晚期基因转录起始位点TAAG和两个TATA box,三个CAAT。Northern blot证明杆状病毒ubi为晚期表达基因,在病毒感染后约12h或更早开始大量表达,并具有多个转录本。 ubi启动子区域缺失分析证明Acubi启动子对病毒因子的主要响应区在ATG上游-595～-382bp;而Bmubi启动子中则主要位于ATG上游-382～-124bp;在ATG上游-383～-187 bp的196 bp启动子片段,含有一个TAAG、CAAT基序和TATA box,也具有启动子的活性。 对ubi启动子进行突变分析发现,TATA box和TAAG突变后均能下调该启动子的活性,而CAAT突变却可以上调启动子的转录活性大约3至4倍左右。 （2）杆状病毒IE-1及hr3对晚期ubi和极晚期polh启动子的作用 在病毒感染的情况下,顺式连接或反式作用的hr3可分别上调ubi启动子活性达62和1.4倍左右;与ie-1共转染时,顺式连接的hr3可上调ubi启动子转录约210;反式作用则为9倍。ubi启动子序列中与ie-1响应的区段主要位于ATG上游-595～-382 bp之间。 对于极晚期polh启动子,在BmNPV感染的细胞中,顺式连接的hr3可增强报告基因表达283倍,反式作用为1.8倍左右;报告质粒与ie-1共转染时,顺式或反式的hr3可分别增强polh启动子控制的报告基因表达621倍和4.2倍。 用报告质粒转染家蚕5龄第二天的幼虫,hr3同样可显著提高ubi和polh启动子的转录活性。 （3）参与杆状病毒晚期基因ubi表达的病毒因子研究 通过构建BmNPV基因组文库,对参与ubi基因转录的病毒因子进行了筛选。单独的立即早期基因ie0、ie2、pe38等对ubi基因启动子没有激活作用,ie-1能反式激活ubi基因启动子的转录,但报告基因的表达量较低。在ie-1存在时,he65、lef-11、lef-6、p35及gp118-gp119,gp104-gp107片段均能启动ubi启动子的转录。 （4）耐高温β-glucosidase在家蚕中的表达及纯化 获得了能够表达β-glucosidase的重组病毒。酶活性为10 199.5 U/毫升血淋巴,19 797.4 U/头蚕。酶的最适反应温度为105 ℃,最适反应pH为5.0,在90-110℃保温10 min,酶活性没有大的影响,当温度升高到140℃时,酶活才会急剧下降;二价离子及高盐对表达的β-glucosidase活性均没有显著影响。初步纯化的上清酶液中含有约80%以上的重组蛋白。耐高温β-glucosidase在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达,为该酶的大规模生产及应用奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 中英文缩略表
• 第一章 研究目的、内容和意义
• 1.1 研究目的
• 1.2 研究内容
• 1.2.1 杆状病毒AcMNPV和BmNPV ubiquitin启动子的特性分析
• 1.2.2 杆状病毒IE-1及hr3对晚期ubiquitin和极晚期polyhedrin启动子的作用
• 1.2.3 病毒因子对杆状病毒泛素基因转录的调控作用
• 1.2.4 耐高温β-gulosidase在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及纯化方法的建立
• 1.3 研究意义
• 第一部分 杆状病毒ubiquitin、polyhedrin基因启动子分析
• 第二章 文献综述
• 2.1 杆状病毒编码泛素的研究进展
• 2.1.1 泛素依赖的蛋白水解系统
• 2.1.2 病毒泛素基因的研究
• 2.2 病毒基因启动子的研究
• 2.2.1 病毒编码的启动子概况
• 2.2.2 几种主要杆状病毒编码启动子研究进展
• 2.2.3 泛素基因启动子研究情况
• 2.3 杆状病毒晚期表达因子的研究
• 2.3.1 参与病毒DNA复制的LEFs
• 2.3.2 参与病毒DNA转录的LEFs
• 2.3.3 其它转录LEFs
• 2.4 杆状病毒泛素启动子的研究意义
• 第三章 材料和方法
• 3.1 细胞的冻存、复苏、传代及病毒繁殖
• 3.1.1 冻存
• 3.1.2 复苏
• 3.2 PCR反应
• 3.2.1 病毒基因组模板
• 3.2.2 质粒模板
• 3.2.3 普通PCR反应体系
• 3.2.4 普通PCR反应条件
• 3.2.5 定点突变PCR
• 3.3 限制性内切酶反应
• 3.4 玻璃奶法纯化回收DNA片段
• 3.5 DNA的连接
• 3.6 荧光素酶报告质粒的构建
• 3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
• 3.7.1 少量制备
• 3.7.2 批量制备
• 3.7.3 质粒转化
• 3.8 质粒DNA抽提
• 3.8.1 小量抽提
• 3.8.2 大量抽提
• 3.9 病毒基因组文库的构建
• 3.9.1 基因组DNA的提取
• 3.9.2 基因组DNA的部分消化和片段的回收
• 3.9.3 连接，转化及扩增
• 3.10 质粒DNA的转染
• 3.11 细胞裂解和荧光素酶活性的测定、蛋白质定量
• 3.11.1 细胞裂解
• 3.11.2 Luciferase活性测定
• 3.11.3 蛋白浓度测定
• 3.12 细胞总RNA的抽提
• 3.13 随机引物法标记杂交探针
• 3.14 Northern blot
• 3.14.1 电泳与转膜
• 3.14.2 杂交、洗膜和冲片
• 第四章 BmNPV、AcMNPV ubiquitin基因启动子的结构与功能分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 杆状病毒ubiquitin基因启动子的序列分析
• 4.2.2 Northern blot分析
• 4.2.3 ubiquitin基因启动子的功能分析
• 4.3 讨论
• 第五章 hr3、ie-1对杆状病毒晚期、极晚期启动子的激活作用
• 5.1 材料方法
• 5.1.1 报告质粒的构建
• 5.1.2 IE-1与ubiquitin基因启动子顺式元件的结合
• 5.1.3 ie-1、hr3对晚期ubiquitin基因启动子的作用
• 5.1.4 ie-1、hr3对极晚期基因polh启动子的作用
• 5.1.5 家蚕饲养和转染
• 5.2 结果
• 5.2.1 功能质粒的构建
• 5.2.2 ie-1、hr3对晚期ubiquitin基因启动子的作用
• 5.2.3 ubiquitin启动子中对ie-1的响应区段研究
• 5.2.4 ie-1、hr3对极晚期polh基因启动子的作用
• 5.3 讨论
• 第六章 参与杆状病毒泛素基因转录的病毒因子的研究
• 6.1 材料方法
• 6.1.1 病毒和细胞
• 6.1.2 BmNPV基因组文库构建、瞬时表达分析
• 6.1.3 DNA共转染
• 6.1.4 重组质粒的构建
• 6.2 结果
• 6.2.1 BmNPV文库DNA对ubiquitin启动子转录的影响
• 6.2.2 对ubiquitin启动子具有激活作用的病毒因子
• 6.2.3 病毒因子的突变分析
• 6.3 讨论
• 第二部分 耐高温葡萄糖苷酶在家蚕杆状病毒中的表达
• 第七章 引言
• 7.1 杆状病毒表达系统研究
• 7.1.1 转移载体的发展
• 7.1.2 亲本病毒及重组介质的改良
• 7.1.3 外源蛋白表达的影响因素
• 7.1.4 表达系统的应用
• 7.2 高温β-葡萄糖苷酶的研究情况
• 7.2.1 β-葡萄糖苷酶主要应用
• 第八章 耐高温葡萄糖苷酶在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达、特性分析及纯化
• 8.1 材料和方法
• 8.1.1 耐高温古细菌（Pyrococcus furiosus）基因组DNA的提取
• 8.1.2 重组表达质粒的构建
• 8.1.3 超速离心法制备病毒Bm-BacPAK6基因组DNA
• 8.1.4 Bm-BacPAK6基因组DNA的线性化
• 8.1.5 共转染
• 8.1.6 重组病毒的筛选、纯化和扩增
• 8.1.7 PCR鉴定外源基因的整合
• 8.1.8 家蚕接种和样品的初步纯化
• 8.1.9 β-glucosidase表达时相
• 8.1.10 SDS-PAGE电泳
• 8.1.11 celB标准曲线的制作
• 8.1.12 耐高温β-glucosidase的活性分析
• 8.2 结果
• 8.2.1 celB基因序列分析及重组质粒的构建
• 8.2.2 同源重组及重组病毒的筛选
• 8.2.3 重组病毒在家蚕中的表达及初步纯化
• 8.2.4 表达的外源蛋白的特性分析
• 8.3 讨论
• 第九章 结论
• 9.1 ubiquitin基因启动子克隆及功能分析
• 9.2 IE-1、hr3对杆状病毒晚期ubiquitin基因启动子的调控
• 9.3 IE-1、hr3对杆状病毒极晚期polh基因启动子的调控
• 9.4 参与ubiquitin基因表达的病毒因子的鉴定
• 9.5 耐高温β-glucosidase的表达及特性分析
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 附录