论文摘要
目的：本研究采用人类促甲状腺激素受体（human thyrotropin receptor，hTSHR）膜外区（extracellular domain，ECD）氨基端的两个片段hTSHRf（188～403bp）、hTSHRe（407～904bp），分别构建重组质粒pcDNA3.1／hTSHRf和pcDNA3.1／hTSHRe，将其转染中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）细胞，在CHO细胞中进行稳定表达；然后用重组质粒免疫BALB／c小鼠，建立Graves病的动物模型。方法：提取人甲状腺正常组织总RNA，逆转录为cDNA，用RT-PCR法扩增hTSHR膜外区两个片段hTSHRf和hTSHRe，回收纯化后，定向插入真核表达载体pcDNA3.1（D）／V5-His-TOPO中，然后转化进入感受态菌株TOP10 E.coli，构建重组质粒pcDNA3.1／hTSHRf、pcDNA3.1／hTSHRe，用限制性内切酶HindⅢ酶切、PCR扩增及测序方法进行核酸序列鉴定。通过Lipofectamine2000脂质体介导法，将重组质粒分别导入CHO细胞，G418筛选阳性克隆细胞株后，RT-PCR法分别扩增两个片段的阳性克隆细胞株，进行目的基因的转录鉴定，裂解转染后的CHO细胞，用Western Blotting鉴定hTSHR在蛋白水平的表达。大量提取重组质粒，并去内毒素后，于第1，4，7，9，10周股四头肌注射免疫BALB／c小鼠，对照组注射生理盐水，分别于第0，6，11周内眦取血，分离血清，于第11周处死小鼠，取小鼠一侧甲状腺常规病理切片，HE染色，观察各组甲状腺形态学变化；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法测定小鼠血清中TRAb的含量；放射免疫测定法（radio immunity assay，RIA）测定血清中TSAb和TBAb的含量；RIA法测定血清中T4的含量。结果：1．PCR扩增所得的两个片段分别为216bp、534bp，与预期的大小相符，所构建的重组质粒经酶切鉴定和PCR鉴定同预期的大小一致，测序结果与Gene Bank中收录的hTSHR的相应片段序列相同，表明重组质粒构建成功；2．以脂质体转染CHO细胞，筛选阳性克隆细胞株后，RT-PCR分别扩增两个片段的阳性克隆株，所得片段大小分别为216bp、534bp，与预期的大小一致，经Western Blotting鉴定重组蛋白有免疫原性，蛋白的分子量分别为11.94KD、23.6KD左右，与预期的大小相符；3．ELISA测定血清中TRAb，结果显示：pcDNA3.1／hTSHRf免疫组第6周高于第0周（P＜0.05），第11周持续增高（P＜0.01）；pcDNA3.1／hTSHRe免疫组第11周明显高于第6周以及第0周（P＜0.05）：对照组血清TRAb含量差别无统计学意义（P＞0.05）；4．RIA法测定血清中TSAb和TBAb指数，TSAb指数：pcDNA3.1／hTSHRf免疫组第6周比第0周明显升高（P＜0.01），第11周持续升高（P＜0.05），pcDNA3.1／hTSHRe免疫组第6周、第11周明显高于第0周（P＜0.05），对照组TSAb指数差别无统计学意义（P＞0.05）；TBAb指数：pcDNA3.1／hTSHRf免疫组、pcDNA3.1／hTSHRe免疫组以及对照组均没有统计学意义（P＞0.05）；5．RIA法测定血清中T4含量，pcDNA3.1／hTSHRf免疫组第11周、第6周明显高于第0周（P＜0.05），pcDNA3.1／hTSHRe免疫组第6周高于第0周（P＜0.01），第11周持续增高（P＜0.05），而对照组血清T4含量差别没有统计学意义（P＞0.05）；6．组织病理学检查，pcDNA3.1／hTSHRf和pcDNA3.1／hTSHRe免疫组的甲状腺组织，可见大量新生滤泡生成，滤泡上皮增生，偶可见炎性细胞浸润；对照组甲状腺组织形态则基本正常。结论：1．成功构建了hTSHR真核表达质粒pcDNA3.1／hTSHRf及pcDNA3.1／hTSHRe；2．脂质体转染CHO细胞，筛选得到阳性克隆细胞株，RT-PCR证明了重组质粒与CHO细胞的基因组整合，并转录成功，Western blotting证实了重组蛋白在体外成功的表达；3．通过对TRAb、TSAb和TBAb指数、T4等指标的测定以及组织病理学检查，证实基因免疫BALB／c小鼠成功建立了Graves病的动物模型。