西伯利亚蓼3-磷酸甘油醛脱氢酶的cDNA克隆及耐盐性分析

论文摘要

本研究根据NaHCO3胁迫下的西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum Laxm.）消减文库中的ETS序列,利用RACE技术,克隆出3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的全长cDNA序列,命名为Ps GAPDH。通过生物信息学方法进行了初步的分析;利用Northern杂交技术对NaHCO3不同胁迫时间下的地下茎、茎及叶的表达模式进行研究;将该基因构建到酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,INVScI）表达载体pYES2,进行酿酒酵母的遗传转化,对转基因酵母的耐盐性进行了研究。主要实验结果如下:（1）Ps GAPDHcDNA序列全长1331 bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。氨基酸序列分子量为36.672 kDa,理论pI值是7.66,蛋白不稳定系数是24.31,属于稳定蛋白。氨基酸同源性比对显示草本植物西伯利亚蓼的GAPDH与其它草本植物的GAPDH基因同源序列相似性较高,最高达到96%;与落叶灌木也具有高的同源性,最高达到93%;且它与其它物种中存在于细胞质的GAPDH基因的氨基酸序列同源性高达96%。推测此基因属于胞质中的GAPDH基因。蛋白比对显示该基因编码蛋白有2个保守的功能域,一个为行使糖运输和代谢的GAPDH功能域;另一个是NAD（P）结合功能域。（2）Northern印记杂交检测显示,NaHCO3胁迫处理的西伯利亚蓼的地下茎、茎及叶片具有不同的表达模式。在叶部胁迫4-24 h过程中,Ps GAPDH表达减少,表现受抑制,48 h后趋于正常。而在茎部在2-8 h,随着胁迫时间的增加表达量增加,表现为诱导,而随后的24-48 h胁迫后表达量趋于正常。而在地下茎中,Ps GAPDH的表达量有微弱的增强。（3）将Ps GAPDH基因与酵母表达载体pYES2连接,获得了pYES-GAPDH重组质粒。将pYES-GAPDH质粒转化到酵母菌INVScI中。随机挑选3个INVScI（pYES-GAPDH）单菌落,经PCR扩增和提取菌液质粒双酶切证明Ps GAPDH基因已构建到pYES2载体上;对INVScI（pYES-GAPDH）和INVScI（pYES2）菌株进行半乳糖诱导,RTPCR证明该基因已经在酵母中成功表达,对转基因酵母进行NaHCO3和NaCl胁迫。结果表明,INVScI（pYES-GAPDH）重组酵母与INVScI（pYES2）相比,在10%NaHCO3和4mol·L-1NaCl胁迫下具有较高的存活率。说明,来源于西伯利亚蓼的GAPDH基因赋予酵母细胞一定的抗盐能力,表现出抗逆性的功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 植物抗胁迫相关分子生物学研究
• 1.2 3-磷酸甘油醛脱氢酶的研究现状
• 1.2.1 3-磷酸甘油醛脱氢酶简介
• 1.2.2 3-磷酸甘油醛脱氢酶在动物中的研究
• 1.2.3 3-磷酸甘油醛脱氢酶在植物中的研究
• 1.2.4 植物GAPDH的亚细胞定位
• 1.2.5 GAPDH在植物中的主要功能
• 1.2.6 GAPDH作为看家基因和内参基因的应用
• 1.3 RACE技术
• 1.4 酿酒酵母作为外源基因表达系统的研究进展
• 1.4.1 用于酿酒酵母基因表达的两类载体
• 1.4.2 酿酒酵母表达外源基因的特点
• 1.5 有关西伯利亚蓼的研究
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 实验材料与试剂
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株与载体
• 2.3 主要试剂
• 2.3.1 酶类及主要试剂
• 2.3.2 酵母转化试剂
• 2.3.3 酵母RNA提取试剂
• 2.3.4 杂交检测试剂
• 2.3.5 总RNA提取试剂
• 2.4 培养基
• 2.5 主要仪器
• 3 实验方法
• 3.1 PsGAPDH基因的3′及5′RACE克隆
• 3.1.1 3′及5′RACE引物的设计
• 3.1.2 西伯利亚蓼总RNA的提取
• 3.1.3 DNA的消化
• 3.1.4 总RNA的反转录
• 3.1.5 3′及5′RACE的PCR反应
• 3.1.6 RACE片段的克隆与测序
• 3.2 全长cDNA序列的扩增
• 3.2.1 全长cDNA序列引物的设计
• 3.2.2 RACE全长的PCR反应
• 3.2.3 RACE全长片段的克隆与测序
• 3.3 PsGAPDH cDNA的序列分析
• 3.4 PsGAPDH基因在西伯利亚蓼中表达的研究
• 3.4.1 探针的制备
• 3.4.2 Northern印迹杂交检测
• 3.5 加酶切位点的全长目的片段的获得及酵母表达载体的构建
• 3.5.1 全长片段的克隆
• 3.5.2 连接产物的转化
• 3.5.3 重组质粒的提取
• 3.5.4 重组质粒的PCR扩增和双酶切检测
• 3.5.5 重组质粒pYES-GAPDH的酵母遗传转化
• 3.5.6 转化酵母的菌落PCR检测
• 3.5.7 含重组质粒PYES2-GAPDH的酵母的RT-PCR检测
• 3.6 INVSCI（pYES-GAPDH）的NaCl胁迫处理
• 3.6.1 INVSCI（pYES-GAPDH）的NaHCO3胁迫处理
• 4 实验结果
• 4.1 西伯利亚蓼总RNA的获得
• 4.2 3′及5′方向序列的扩增
• 4.3 全长cDNA序列的扩增
• 4.4 克隆产物的PCR鉴定
• 4.5 PsGAPDH基因的全长cDNA序列分析
• 4.6 PsGAPDH基因在西伯利亚蓼中的表达
• 4.6.1 西伯利亚蓼总RNA的获得
• 4.6.2 Northern杂交结果
• 4.7 重组质粒PYES2-GAPDH的PCR扩增检测和双酶切检测
• 4.8 重组质粒PYES2-GAPDH的酵母PCR检测
• 4.9 含重组质粒PYES2-GAPDH的酵母的RT-PCR检测
• 4.10 INVSCI（pYES-GAPDH）重组酵母的抗盐胁迫分析
• 5 讨论
• 5.1 PsGAPDH基因的属性分析
• 5.2 PsGAPDH基因的进化分析
• 5.3 PsGAPDH基因的抗性分析
• 5.4 西伯利亚蓼PsGAPDH基因的northern杂交分析
• 5.5 西伯利亚蓼的耐盐机制分析
• 5.6 GAPDH基因不同时期表达量变化分析
• 6 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢