补体C5a在败血症中作用机理研究

论文摘要

败血症是一类因多种病原菌进入血液系统后迅速繁殖、产生大量毒素,激发机体免疫系统产生的过度炎症性反应,致死率极高。在西方发达国家,大约每年有150万人患病,死亡率高达30%-50%。由于败血症是炎症反应所引起的自身损伤性疾病,如何及时终止机体过度的炎症反应,恢复正常的免疫功能就成了该领域研究的热点和难点。目前认为机体释放大量炎症介质如TNF-α、LPS、以及IL-6等导致的急性炎症反应综合征是败血症的重要致病机制。为了寻求干预败血症的有效治疗途径,众多的研究都以上述炎症介质为靶点。然而系统的研究发现用抗体中和TNF-α或LPS防治败血症的临床实验并没有出现预期的降低死亡率的效果,清除IL-6的作用也不能降低败血症的死亡率,败血症的防治目前尚缺乏有效手段。因此如何从不同的角度认识败血症的致病机制,进而寻求有效的干预策略是目前该领域研究的重点。近几年来补体系统在败血症致病机制中的作用正日益受到人们的关注。补体系统可以通过级联活化、释放一系列炎症介质如C3a、C5a等介导炎症反应。研究证实,在败血症条件下补体C5a的过度释放是导致炎症反应综合征的关键因素。C5a具有过敏毒素作用,通过直接作用于血管内皮细胞可以增加血管的通透性,还可以对噬碱性粒细胞、中性粒细胞、单核-巨噬细胞、肥大细胞发挥趋化作用,诱导单核细胞分泌IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等细胞因子。一些初步的研究表明阻断C5a的作用能在动物模型中降低败血症的死亡率,为了进一步明确将C5a作为败血症治疗靶点的可行性,有必要对C5a介导炎症反应的机制、关键环节等进行深入的研究。最近炎症介质IL-17在自身免疫性、慢性炎症中的作用提示它是新的有价值的干预靶点,而对于IL-17在急性炎症反应中的作用是目前尚不清楚而大家非常关注的课题。近来对于IL-17功能认识的深化源于新发现的一个CD4+T细胞亚群,即Th17细胞。除了Th17细胞外,资料证实γδT细胞也是分泌IL-17炎症介质的一个重要来源。尽管目前人们对于IL-17在自身免疫性疾病中的产生及作用有了深入的认识,但在急性感染条件下IL-17产生及致病机制如何?是否可以作为急性感染性疾病防治的新靶点等尚不清楚。树突状细胞（DC）是专职的抗原提呈细胞（APC）,也是机体免疫防御系统的重要组成部分。DC细胞通过释放各种细胞因子,引起Th1或者Th2极化。目前认为,DC细胞可以决定感染过程中免疫反应发生的类型。败血症的发病过程中,DC细胞迅速成熟但缺乏启动保护性Th1反应的能力,而这种针对病原菌入侵的防御反应能力缺失与补体C5a的关系已经得到初步证实。因DC细胞表面同样发现C5a受体的表达,使得DC细胞成为研究C5a如何调控炎症反应的重要靶点。为了从不同的角度认识败血症的致病机制,本研究首先用C57BL/6小鼠建立了败血症动物模型,动态观察了IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17等炎症介质在败血症动物模型中的变化。发现C5a、IL-17均在败血症中发挥重要作用,率先明确了败血症体内存在C5a—IL-17炎症反应通路,为从新的角度认识败血症的致病机制提供了实验依据。本研究具体的研究内容及结果有以下几个方面。（一）败血症动物模型的建立及鉴定为了探讨败血症的致病机制,我们首先用盲肠结扎穿孔（Cecal ligation puncture）方法建立了败血症动物模型。为了减少单纯麻醉、开腹及手术缝合处理对动物生存状况的影响,我们将对动物只进行上述操作但不进行盲肠结扎穿孔作为对照组,结果显示败血症发生后:动物整体生存状态较差,5天生存率仅为20%-25%,体重降低明显,出现脾脏肿大;胸腺及脾脏组织出现病理改变;淋巴细胞出现大量凋亡;多种炎性因子包括TNF-α、IL-6、INF-γ、IL-17表达升高。而对照组动物生存状况未受到影响。上述结果表明我们成功建立了败血症模型,为我们探讨败血症致病机制奠定了坚实的基础。（二）补体C5a在败血症发病中与炎症因子相关性研究为了探讨败血症关键的炎症介质,本部分重点对C5a、IL-17在败血症中的作用、变化及其相关关系进行了深入的探讨。具体方法包括1)制备抗C5a抗体;2)抗体体内中和试验;3)IL-17的动态变化;4)C5a与IL-17表达的相关性。结论:C5a是败血症重要的炎症介质,C5a的大量释放可能是体内诱导IL-17表达升高、进而导致自身免疫损伤的一个重要机制。为了验证败血症中是否存在C5a—IL-17通路,我们进行了第三部分实验。（三）DC细胞在补体C5a介导的炎性因子IL-17分泌中的作用为了验证C5a是否可以诱导IL-17的表达,我们首先进行了体外验证,我们采用的体外模型是C5a—DC—LN—IL-17系统。我们的结果表明C5a可以通过活化DC细胞间接上调淋巴细胞分泌IL-17,其作用机制与细胞因子IL-6、TGF-β相关。同时我们发现败血症中γδT细胞是分泌IL-17的主要细胞之一。结论:通过体外实验证实C5a可以通过不同的机制调控炎症因子IL-17的分泌。（四）败血症动物体内补体C5a调节IL-17表达的可能机制由于我们发现IL-17相关的C5a途径,接下来IL-17在败血症表达产生机制如何是我们关注的焦点。我们首先明确了败血症动物体内γδT细胞可以分泌大量IL-17。败血症可以直接影响γδT细胞比例及其分泌IL-17能力。通过抗C5a抗体证实C5a可以通过调节γδT细胞功能影响IL-17表达。结论:通过体内实验证实γδT细胞是分泌IL-17的主要来源之一,C5a可以通过影响γδT细胞功能调控IL-17的表达。本研究以败血症盲肠结扎穿孔模型（CLP）为研究对象,通过体内及体外两部分实验验证补体C5a调控炎性因子IL-17的可能机制。体外实验结果证实补体C5a通过与DC细胞表面C5aR结合,以细胞因子IL-6和TGF-β依赖方式上调淋巴细胞分泌IL-17水平,而γδT细胞是分泌IL-17的主要来源之一。体内实验也初步证实了C5a—γδT—IL-17的调控关系,C5a与炎性因子IL-17调控关系的阐明将为败血症发病机理的研究提供新的思路。

论文目录

• 英文缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 败血症动物模型的建立及鉴定
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第二部分 补体C5a 在败血症发病中与炎症因子相关性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三部分 DC 细胞在补体C5a 介导的炎性因子IL-17 分泌中的作用
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四部分 败血症动物体内补体C5a 调节IL-17 表达的可能机制
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表文章
• 攻读博士学位期间参与课题
• 攻读博士学位期间参加的会议