ZS-TRAIL基因的克隆表达及其抗肿瘤活性与机理研究

论文摘要

TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligind）是肿瘤坏死因子超家族成员之一。其选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无明显杀伤作用的特性,使之成为抗肿瘤新药研究的一个热点。目前,TRAIL已通过Ⅰ期临床试验,并已进入Ⅱ期临床研究。国内外Ⅰ期临床结果显示,TRAIL毒副作用低、无免疫原性,在临床上具有较大的潜在应用价值。然而,TRAIL存在生物活性不强的缺点。添加寡聚化结构域能有效提高TNF家族蛋白的生物活性。因此,本研究在TRAIL基础上添加人源三聚化结构域ZS,希望提高TRAIL生物活性,进而将其开发成抗肿瘤新药。主要研究结果如下:1、TRAIL和ZS-TRAIL基因的克隆表达及产物纯化通过RT-PCR技术扩增人TRAIL114-281序列,通过重叠延伸PCR技术扩增人ZS-TRAIL序列,扩增产物克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a,并在大肠杆菌BL21（DE3）中实现高表达。通过亲和层析和离子交换层析两步纯化得到目的蛋白。纯化后的TRAIL和ZS-TRAIL经反相HPLC测定纯度均大于95%;经Western印迹实验显示均有明显抗原性;经ESI质谱测定其分子量与理论值一致;CD结果显示两者结构紧密。2、TRAIL和ZS-TRAIL体外抗肿瘤活性比较用SRB法测定TRAIL和ZS-TRAIL的体外抗肿瘤活性。结果显示:TRAIL和ZS-TRAIL能有效杀伤人肺腺癌SPC-A1细胞、人回盲肠腺癌HCT-8细胞、人肝癌BEL-7402细胞、人白血病HL-60细胞等多种肿瘤细胞,且呈剂量依赖性。ZS-TRAIL的肿瘤细胞杀伤能力比TRAIL强。ZS-TRAIL和TRAIL均对正常肝细胞LO2无杀伤作用。3、TRAIL和KS-TRAIL体内抗肿瘤活性比较建立荷瘤裸鼠模型,比较TRAIL和ZS-TRAIL的体内抗肿瘤活性。结果显示,ZS-TRAIL对人回盲肠腺癌HCT-8模型和人体肺腺癌SPC-A1模型的抗肿瘤疗效均优于TRAIL,且高剂量（80mg/kg）ZS-TRAIL和TRAIL对荷瘤裸鼠模型动物均无肝毒性。4、ZS-TRAIL的体内外抗肿瘤活性高于TRAIL的机理探讨寡聚化状态分析表明,ZS-TRAIL和TRAIL主要以高活性同源三聚体形式存在。药物代谢动力学结果显示,ZS-TRAIL与TRAIL半衰期无显著差异。稳定性分析表明,TRAIL热稳定性优于ZS-TRAIL;但在贴近细胞生长条件（37℃）特别是在含人血白蛋白的条件下,ZS-TRAIL比TRAIL稳定。推测ZS-TRAIL抗肿瘤活性提高与其贴近细胞生长条件下稳定性高有关。进一步研究发现ZS-TRAIL抗肿瘤活性高于TRAIL可能与其Zn2+结合能力强有关。5、ZS-TRAIL表达条件优化用响应面法对可溶性ZS-TRAIL表达条件进行优化,最佳表达条件为:酵母提取物11.38 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、Kan 30μg/mL、IPTG 0.1mM、诱导温度29.2℃、诱导时间6h、ZnSO4浓度0.458mM。优化后,可溶性ZS-TRAIL产量提高4倍。运用优化结果进行高密度发酵,可溶性ZS-TRAIL产量达到4.26g/L。

论文目录

• 致谢
• 英文缩略词（ABBREVIATION）
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 TRAIL与肿瘤治疗
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 TRAIL及其受体
• 1.1.3 TRAIL的凋亡诱导机理
• 1.1.3.1 TRAIL的凋亡诱导途径
• 1.1.3.2 影响TRAIL凋亡诱导活性的因素和途径
• 1.1.4 TRAIL在肿瘤治疗上的应用
• 1.1.4.1 TRAIL抗肿瘤活性
• 1.1.4.2 TRAIL与其他药物联合应用
• 1.1.4.3 TRAIL对正常细胞的潜在毒性
• 1.1.4.4 TRAIL的临床研究
• 1.2 卷曲螺旋结构
• 1.2.1 卷曲螺旋的概述
• 1.2.2 卷曲螺旋的结构特征
• 1.2.3 卷曲螺旋与融合蛋白的构建
• 1.3 本研究的研究目的与研究内容
• 第二章 人可溶性TRAIL和ZS-TRAIL的基因克隆、表达及纯化
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌种和质粒
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 培养基和缓冲液的配制
• 2.2.4 主要仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 TRAIL114-281 cDNA的扩增
• 2.3.1.1 人外周血单个核细胞的分离
• 2.3.1.2 外周血单个核细胞培养和激活
• 2.3.1.3 外周血单个核细胞总RNA的抽提
• 2.3.1.4 RT-PCR反应
• 2.3.1.4.1 引物设计
• 2.3.1.4.2 RT-PCR扩增
• 2.3.2 ZS-TRAIL序列的扩增
• 2.3.2.1 ZS的合成
• 2.3.2.2 重叠延伸PCR技术扩增ZS-TRAIL
• 2.3.3 重组质粒的构建
• 2.3.3.1 PCR产物及质粒的酶切
• 2.3.3.2 酶切产物电泳并割胶回收
• 2.3.3.3 外源DNA与质粒的连接
• 2.3.3.4 感受态细胞的制备
• 2.3.3.5 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.3.3.6 转化子的挑选及鉴定
• 2.3.3.6.1 菌落PCR
• 2.3.3.6.2 小批量质粒DNA的抽提
• 2.3.3.6.3 双酶切及测序
• 2.3.4 工程菌的诱导表达
• 2.3.5 SDS-PAGE电泳
• 2.3.6 发酵罐规模的发酵
• 2.3.7 表达蛋白的分离纯化
• 2.3.8 目的蛋白的鉴定-Western blot检验
• 2.3.9 蛋白浓度的测定-BCA法
• 2.3.10 纯度鉴定-HPLC
• 2.3.11 目的蛋白分子量的鉴定-ESI质谱
• 2.3.12 二、三级结构的分析-CD法
• 2.4 结果
• 2.4.1 TRAIL114-281 cDNA的扩增
• 2.4.2 ZS-TRAIL序列的扩增
• 2.4.3 重组质粒的构建
• 2.4.4 工程菌的诱导表达
• 2.4.5 发酵罐规模的发酵
• 2.4.6 表达蛋白的分离纯化
• 2.4.7 目标蛋白的鉴定-Western blot检验
• 2.4.8 纯度鉴定-HPLC
• 2.4.9 目的蛋白分子量的鉴定-ESI质谱
• 2.4.10 二、三级结构的分析-CD法
• 2.5 讨论
• 2.5.1 人TRAIL和ZS-TRAIL基因的克隆表达
• 2.5.2 基因工程菌的发酵及目的蛋白的纯化
• 2.5.3 纯化产物的质量分析
• 2.6 本章小结
• 第三章 ZS-TRAIL和TRAIL体内外抗肿瘤活性比较
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 细胞株
• 3.2.2 实验动物
• 3.2.3 荷瘤裸鼠模型
• 3.2.4 试剂
• 3.2.5 主要溶液的配制
• 3.2.6 仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 ZS-TRAIL和TRAIL体外抗肿瘤活性的测定
• 3.3.1.1 细胞培养
• 3.3.1.2 SRB法检测细胞生长抑制率
• 3.3.2 ZS-TRAIL和TRAIL体内抗肿瘤活性的测定:荷瘤裸鼠模型
• 3.3.2.1 荷人肠癌HCT-8裸鼠模型
• 3.3.2.2 荷人肺腺癌SPC-A1裸鼠模型
• 3.3.3 肝功能生化指标的测试
• 3.3.4 统计学方法
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 体外抗肿瘤活性
• 3.4.2 ZS-TRAIL和TRAIL对荷人肠癌HCT-8裸鼠模型的抗肿瘤作用
• 3.4.3 ZS-TRAIL和TRAIL对荷人肺腺癌SPC-A1裸鼠模型的抗肿瘤作用
• 3.4.4 ZS-TRAIL、TRAIL样品对荷瘤模型动物肝功能生化指标的影响
• 3.5 讨论
• 3.6 本章小结
• 第四章 ZS-TRAIL抗肿瘤活性优于TRAIL机理初探
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要溶液及缓冲液的配制
• 4.2.4 主要仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 透析
• 4.3.2 圆二色谱法分析Tm值
• 4.3.3 SEC-HPLC测寡聚化状态
• 4.3.4 交联测寡聚化状态
• 4.3.5 SDS-PAGE快速银染
• 4.3.6 非还原SDS-PAGE分析
• 4.3.7 药物代谢动力学研究—双抗体夹心ELISA法
• 4.3.8 37℃、4℃条件下稳定性比较实验
• 4.3.9 人血白蛋白（HSA）对TRAIL及ZS-TRAIL稳定性影响
• 4.3.10 火焰原子吸收光谱法测锌离子含量
• 4.3.11 数据分析
• 4.4 结果
• 4.4.1 ZS-TRAIL和TRAIL寡聚化状态比较
• 4.4.1.1 SEC-HPLC
• 4.4.1.2 交联
• 4.4.1.3 非还原SDS-PAGE电泳
• 2+含量的比较'>4.4.1.4 Zn²⁺含量的比较
• 4.4.2 ZS-TRAIL和TRAIL稳定性比较
• 4.4.2.1 热稳定性比较（Tm值）
• 4.4.2.2 贴近生理条件下（37℃）TRAIL和ZS-TRAIL稳定性比较实验
• 4.4.2.3 4℃条件下TRAIL和ZS-TRAIL稳定性比较实验
• 4.4.2.4 人血白蛋白对TRAIL和ZS-TRAIL稳定性影响
• 4.4.3 ZS-TRAIL和TRAIL半衰期比较
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 第五章 ZS-TRAIL表达条件的优化
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 培养基及培养条件
• 5.2.3 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 响应面法确定ZS-TRAIL最佳可溶性表达条件
• 5.3.1.1 Plackett-Burman设计
• 5.3.1.2 最陡坡实验设计
• 5.3.1.3 中心组合实验设计
• 5.3.1.4 验证实验
• 5.3.2 高密度发酵
• 5.3.2.1 发酵参数
• 5.3.2.2 pH-stat分批补料发酵方法
• 5.3.3 目的蛋白的分离纯化
• 5.3.4 数据测定和分析方法
• 600测定方法'>5.3.4.1 细胞密度0D₆₀₀测定方法
• 5.3.4.2 细胞干重测定方法
• 5.3.4.3 蛋白浓度的测定
• 5.3.4.4 数据分析
• 5.4 结果
• 5.4.1 Plackett-Burman实验结果
• 5.4.2 最陡坡试验结果
• 5.4.3 中心组合实验和响应面分析
• 5.4.4 最佳培养条件的验证实验
• 5.4.5 高密度发酵
• 5.4.6 目的蛋白的分离纯化
• 5.5 讨论
• 5.5.1 响应面法优化表达条件
• 5.5.2 高密度发酵
• 5.6 本章小结
• 第六章 全文总结及后续工作建议
• 6.1 全文总结
• 6.2 本文创新点
• 6.3 后续工作建议
• 参考文献
• 作者简历