论文摘要
重要农艺性状基因紧密连锁标记的获得,对于进行性状分子标记辅助选择,提高育种的选择效率与预见性,加快新品种的选育进程具有重要意义。红花（Carthamus tinctorius L.）是为菊科1-2年生草本植物,在我国,多作药用植物栽培,以花入药,是重要的活血化瘀中药。苞叶无刺是红花的重要农艺性状,培育无刺品种是药用红花育种的重要目标之一。因此,从DNA乃至cDNA水平研究与红花苞叶刺紧密相关的基因,将为分子标记辅助培育无刺红花品种、加速红花育种进程奠定基础,同时为从分子水平调控红花品种提供有效途径。相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是一种新型的基于PCR的标记技术,该标记通过独特的引物设计对可读框（open reading frames,ORFs）进行扩增。因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。该标记将AFLP和RAPD两种方法的优点有机的结合起来,具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点。本研究采用分离体分组混合分析法（bulk segregate analysis,BSA）,以红花杂交F2代单株苞叶刺多而长、苞叶无刺的极端性状为依据,构建红花苞叶有刺与无刺DNA、RNA两个近等基因池。利用DNA-SRAP标记技术,在基因池间筛选45对引物,通过亲本及F2代分离群体的单株验证,获得与红花苞叶刺性状连锁的1个SRAP标记,命名为M3E3,经测序,其精确长度为349bp。进一步,采用cDNA-SRAP方法,从表达水平探讨与红花苞叶刺相关的基因片段,通过60对引物对基因池进行RT-PCR扩增,共有19对引物具有多态性带型,在此基础上,在亲本和基因池中进行共同筛选,引物Me3/Em4,Me5/Em2,Me3/Em6,Me2/Em1扩增出多态性条带SRAP-1、SRAP-2、SRAP-3、SRAP-4、SRAP-5和SRAP-6,表现出有刺亲本、有刺池有特异带,而无刺亲本、无刺池无特异带。通过F2代分离群体单株对SRAP-1、SRAP-2、SRAP-3、SRAP-4、SRAP-5和SRAP-6进行验证并计算交换率。标记SRAP-1、SRAP-2、SRAP-3和SRAP-4的交换率与有刺红花之间具有较高的交换率,分别为32.9%,45.7%,35.7%和61.4%,说明标记与红花苞叶刺性状不存在紧密连锁关系;标记SRAP-5、SRAP-6的交换率较低,分别为7.1%和4.3%,与红花苞叶刺性状紧密连锁,为特异性cDNA片段,经测序,这2条片段的精确长度分别为278bp和150bp。本研究将序列为278bp的片段命名为GPY-1,序列为150bp的片段命名为GPY-2。利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术,根据GPY-2的序列设计并合成引物,克隆全长cDNA。获得了与红花苞叶刺性状紧密连锁的GPY-2全长cDNA序列及其基因组序列。GPY-2的cDNA序列全长1679 bp （GenBank Accession No: EF104641）,其含有一个1524bp的开放阅读框（ORF）,编码508个氨基酸残基的蛋白。5’非翻译区（untranslated regions）为80bp,3’非翻译区为75bp。采用基因组DNA模板扩增得到与此相同的条带,测序结果与GPY-2全长cDNA序列亦完全一致,表明与GPY-2全长cDNA对应的基因组序列中不存在内含子。序列分析结果表明GPY-2的氨基酸序列与叶绿体基因组ATP合酶CF1亚单位具有较高的相似性。本研究成果,为红花无刺品种种质资源的评价与利用以及分子标记辅助育种提供有效途径。更为重要的是与红花苞叶刺紧密连锁的全长基因的获得,为进一步研究调控红花苞叶刺性状的功能基因奠定了基础。
论文目录
相关论文文献
标签：红花论文; 苞叶论文; 分离体分组混合分析法论文; 分子标记论文; 分子克隆论文; 末端快速扩增论文; 生物信息学论文;