激活瞬时受体电位香草醛亚家族1提高小鼠运动耐量的机制研究

论文摘要

背景和目的:运动耐量是机体对运动的适应能力,与骨骼肌能量代谢密切相关。骨骼肌是葡萄糖和脂肪代谢的主要场所,骨骼肌的纤维类型、线粒体含量和关键酶活性是影响骨骼肌氧化能力和运动耐量的重要因素。提高运动耐量可以增加骨骼肌线粒体含量、促进脂肪分解和氧化,增加能量消耗,从而减少心血管代谢危险因素。因此,提高运动耐量的策略及分子机制研究对心血管代谢病的防治具有重要意义。既往研究发现,辣椒素具有增加运动耐量和能量消耗的作用。经胃管给予辣椒素后2小时,啮齿类动物运动耐量明显提高。健康成人口服一定量辣椒素后耗氧量和脂肪动员迅速增加。这种辣椒素的短期效应与儿茶酚胺水平升高有关,而是否与辣椒素的受体——瞬时受体电位香草醛亚家族1（Transient receptor potential vanilloid subfamily member 1 ,TRPV1）有关尚不明确。辣椒素的长期效应亦未见报道。神经细胞TRPV1通道可被高温、酸性环境、脂质、辣椒素等物质激活,导致以Ca2+为主的跨膜离子流动,进而激活一系列细胞内信号,参与多种伤害性刺激的分辨和整合以及炎症反应。我们既往还发现,辣椒素可激活脂肪细胞TRPV1导致细胞内钙增加,减少脂质在细胞内的堆积,辣椒素长期干预可预防高脂饮食诱导的肥胖。据报道,TRPV1在大鼠骨骼肌细胞也有表达,其生理意义还不清楚。我们推测,激活TRPV1可能与运动耐量的提高有关。AMPK、p-AMPK、PPARδ、PGC-1α、UCP3、PEPCK-C都是近年来颇受关注的参与运动耐量调节的分子,并且可能受细胞钙信号的调控。因此我们进一步推测,激活TRPV1可能通过细胞内Ca2+变化影响上述运动耐量相关分子的表达,从而提高运动耐量。为了验证上述推测,本研究分为三部分进行。第一部分通过蛋白免疫印迹、RT-PCR和免疫荧光染色证实TRPV1在小鼠骨骼肌组织和C2C12小鼠骨骼肌细胞系的表达,明确其分布以及辣椒素干预对其表达有何影响,还通过检测辣椒素刺激下的细胞内钙离子浓度（[Ca2+]i）变化明确骨骼肌细胞上的TRPV1通道是否具有功能。第二部分分题一通过长期辣椒素饮食干预C57/BL6J野生型小鼠和TRPV1基因敲除型小鼠,观察TRPV1激活后对运动耐量相关表型的影响;分题二通过建立TRPV1过表达的转基因小鼠模型并对比观察该转基因小鼠与其同窝野生型对照小鼠的运动耐量相关表型,进一步证实TRPV1在运动耐量调节中的关键作用。第三部分通过检测各组动物骨骼肌运动耐量相关分子的表达,明确TRPV1激活后发挥作用的主要靶分子,并通过细胞实验明确TRPV1激活引起的细胞钙信号变化是否可影响该靶分子的表达。材料与方法:整个研究包括离体实验和在体实验。离体实验以C2C12小鼠成肌细胞以及TRPV1基因干扰的C2C12成肌细胞为模型,成肌细胞用含2%马血清的培养基诱导分化为成熟的骨骼肌细胞后用于所有细胞试验。在体试验采用了多种动物模型。首先以C57/BL6J野生型和TRPV1基因敲除（TRPV1-/-）小鼠为模型,各分为辣椒素组（含辣椒素饲料喂养）和对照组（普通饲料喂养）。另外,我们还构建了TRPV1过表达的转基因（TRPV1-tg）小鼠,并与其同窝野生型小鼠对比,观察运动耐量相关表型。1.使用慢病毒系统进行C2C12成肌细胞TRPV1的特异性RNA干扰。2.分别用蛋白免疫印迹、RT-PCR检测TRPV1蛋白和mRNA的表达;用免疫荧光染色观察TRPV1在C2C12肌细胞和小鼠骨骼肌组织的具体分布。3.比率荧光成像系统检测辣椒素刺激下C2C12肌细胞[Ca2+]i的变化,观察TRPV1基因干扰和TRPV1特异性拮抗剂辣椒卓平对钙信号变化的影响,并分别观察在含钙或不含钙的细胞外液中辣椒素刺激引起的C2C12肌细胞[Ca2+]i的变化。4.显微注射法构建TRPV1过表达的转基因小鼠。5.使用活动跑台检测各组小鼠的运动耐量;使用动物呼吸测量系统检测各组小鼠的耗氧量;ATP酶异染性染色方法检测小鼠腓肠肌纤维类型;蛋白免疫印迹法检测骨骼肌I型纤维标志物troponin-ss和脂肪酸转运子FAT/CD36的表达;血清乳酸、游离脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、血糖、胰岛素等生化指标的检测均按照试剂盒说明书进行。6.蛋白免疫印迹法检测小鼠骨骼肌各运动耐量相关分子（AMPK、p-AMPK、PPARδ、PGC-1α、UCP3、PEPCK-C）的蛋白表达,RT-PCR检测PEPCK-C mRNA的表达。7.分别用辣椒素和Ca2+-ATP酶抑制剂毒胡萝卜素在含钙或无钙的细胞外液中刺激C2C12肌细胞,蛋白免疫印迹法检测PEPCK-C的蛋白表达,以明确不同的钙信号对PEPCK-C表达的影响。结果:1. TRPV1在C2C12肌细胞和小鼠骨骼肌细胞的细胞膜和肌浆网均有表达,辣椒素刺激可显著上调C2C12肌细胞TRPV1的蛋白表达。2.辣椒素刺激C2C12肌细胞引起浓度依赖性的[Ca2+]i升高, TRPV1基因干扰或辣椒卓平预处理可抑制这种细胞内钙信号的变化。3.辣椒素刺激引起的C2C12肌细胞内钙信号的变化是由细胞内TRPV1敏感的钙库钙离子释放和细胞膜上TRPV1介导的细胞外钙离子内流两部分组成的。4.辣椒素饮食干预可长期显著提高野生型小鼠的运动耐量,增加耗氧量和腓肠肌I型肌纤维含量,上调骨骼肌Troponin-ss和FAT/CD36的表达,减少内脏脂肪的堆积,降低血清甘油三酯、游离脂肪酸和乳酸水平,但对TRPV1-/-小鼠无显著影响。5.成功构建了TRPV1蛋白显著过表达的转基因小鼠。与同窝野生型小鼠相比,TRPV1过表达的转基因小鼠运动耐量和耗氧量均显著增加,腓肠肌Troponin-ss的表达显著上调,但体重和进食量均无显著差异。6.辣椒素饮食干预或使用遗传学技术使TRPV1过表达对小鼠骨骼肌AMPK、p-AMPK、PPARδ、PGC-1α、UCP3的蛋白表达无显著影响。7.辣椒素饮食干预可显著上调野生型小鼠骨骼肌PEPCK-C的mRNA和蛋白表达,但对TRPV1-/-小鼠骨骼肌PEPCK-C的mRNA和蛋白表达无显著影响;与同窝野生型小鼠相比,TRPV1-tg小鼠骨骼肌PEPCK-C的蛋白表达亦显著升高。8.辣椒素刺激C2C12肌细胞可上调PEPCK-C的蛋白表达,而TRPV1基因干扰或辣椒卓平处理可抑制PEPCK-C表达水平的上调。9.在含钙的细胞外液中,辣椒素和毒胡萝卜素刺激均可导致[Ca2+]i升高和PEPCK-C表达的上调;在无钙的细胞外液中,辣椒素和毒胡萝卜素刺激只能导致细胞内钙库钙离子的释放,不能上调PEPCK-C的蛋白表达。结论:1. TRPV1在小鼠骨骼肌和C2C12肌细胞均有表达。辣椒素刺激引起的肌细胞内钙离子浓度的变化由肌浆网上TRPV1依赖的钙库钙离子释放和细胞膜上TRPV1介导的细胞外钙离子内流共同组成。2.辣椒素激活TRPV1或遗传学技术上调TRPV1均可提高小鼠的运动耐量、耗氧量和骨骼肌I型纤维含量。激活TRPV1还可促进骨骼肌脂质氧化、减少糖酵解,降低血清乳酸、游离脂肪酸和甘油三酯水平。3.激活或上调TRPV1通过增加细胞外Ca2+内流上调小鼠骨骼肌PEPCK-C mRNA和蛋白的表达,但对AMPK、p-AMPK、PPARδ、PGC-1α、UCP3的蛋白表达均无显著影响,提示TRPV1激活后主要通过上调PEPCK-C提高运动耐量。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 激活瞬时受体电位香草醛亚家族1 提高小鼠运动耐量的机制研究
• 前言
• 第一部分 TRPV1 在C2C12 细胞和小鼠骨骼肌的表达与功能
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 激活或上调TRPV1 对小鼠运动耐量的影响
• 分题一 辣椒素对野生型小鼠和TRPV1基因敲除小鼠运动耐量与能量代谢的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 分题二 TRPV1 过表达小鼠模型的建立及其运动耐量相关表型
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 激活TRPV1 提高运动耐量的分子机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 文献综述 运动耐量和骨骼肌能量代谢的调节及其与心血管代谢病的关系
• 参考文献
• 在读期间发表的论文
• 英文论著