重金属镉人工抗原构建及其多克隆抗体的制备

论文摘要

镉（Cadmium, Cd）是最常见的污染食品和饮料的重金属元素之一。Cd可以通过环境污染,生物浓缩和含Cd化肥的使用而导致食品和水体的污染。我国水稻、蔬菜等农作物Cd的检出率较高,超标现象严重。它具有较强的肾毒性、肝毒性、生殖毒性、免疫毒性、骨骼毒性、心脑血管毒性以及致癌等危害。目前,Cd的检测方法主要是仪器方法。该方法具有测量精度高,结果重复性好,特异性好,但大多需要借助大型仪器,成本较高,且前处理繁琐,不能满足现场、在线分析检测。而ELISA等免疫学方法,以其简单、快速、成本低且适应环境及市场的现场检测等优点受到广泛青睐。本研究采用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA构建了Cd离子的人工抗原,并采用紫外光谱法、三硝基苯磺酸法、原子吸收光谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳以及X射线吸收精细结构光谱对其进行分析鉴定。然后以构建成功的人工抗原免疫BALB/c小鼠,采用ELISA方法对抗血清的各项特性进行了研究,并采用间接竞争ELISA进行了加标回收和实际水样的检测,具体内容如下：1镉离子人工抗原的构建Cd是金属元素,分子量仅为112.4,它既没有反应原性,又没有免疫原性,只有通过双功能螫合剂与蛋白质等载体偶联后,才能刺激机体体产生抗体。本实验利用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA （2-（4-isothiocyanatobenzyl）-diethylenetriaminepentaacetic acid,2-（4-异硫氰酸根苄基）-二乙烯三胺五乙酸）上的DTPA基团螯合Cd离子,并通过其SCN与载体蛋白牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）的游离氨基偶联,制备得到免疫抗原Cd-p-SCN-Bn-DTPA-BSA （Cd-BSA）和包被抗原Cd-p-SCN-Bn-DTPA-OVA （Cd-OVA）。同时,为了分析Cd的偶联情况,还构建了p-SCN-Bn-DTPA-BSA （DTPA-BSA）、p-SCN-Bn-DTPA-OVA （DTPA-OVA）和Cd-DTPA。2镉离子人工抗原的表征通过BSA、OVA、DTPA-BSA和DTPA-OVA的紫外光谱扫描分析,发现DTPA-BSA和DTPA-OVA的最大吸收波长较BSA和OVA发生了微弱的蓝移,分别是278 nm到270nm （BSA）和280 nm到268nm （OVA）,它们的紫外扫描曲线也发生了改变。采用2,4,6-三硝基苯磺酸法（triniro-benzene-sulfonic-acid）法对Cd-BSA和Cd-OVA中游离氨基含量进行了测定,Cd-BSA中游离氨基数目为BSA的48.8%,而Cd-OVA的为OVA的41.4%。SDS-PAGE结果表明,BSA （OVA）、DTPA-BSA (DTPA-OVA和Cd-BSA （Cd-OVA）的分子量是依次递增的。扩展X射线吸收精细结构光谱（extended X-ray absorption fine structure）结果表明,Cd-DTPA、Cd-BSA和Cd-OVA中Cd2+的配位类型及配位数基本相同。同时,它们的X射线吸收近边结构光谱（X-ray absorption near edge structure）结果表明,Cd-BSA和Cd-OVA中Cd2+的吸收边位置、形状、吸收峰强度均与Cd-DTPA的类似。吸收边位置相似表明,Cd-DTPA、Cd-BSA、Cd-OVA三种抗原中Cd离子的局部结构是一致的；吸收边形状相似,说明Cd-BSA和Cd-OVA与Cd-DTPA中Cd2+与DTPA形成螫合物的；吸收峰强度一致,则表明两种人工抗原中的Cd与Cd-DTPA中Cd一样均呈+2价。综上所述,人工抗原Cd-BSA和Cd-OVA构建成功。根据Cd-BSA和Cd-OVA的中游离氨基的替换率,结合它们的蛋白质含量,计算得出Cd-BSA和Cd-OVA中Cd2+与BSA和OVA的摩尔比分为28.7：1和11.7：1。3抗镉离子抗血清的制备及其性质分析以Cd-BSA免疫三组BABL/c小鼠,每组三只。免疫周期均为首次免疫21d,后续加强免疫均为14d,免疫剂量依次为200、100和50μg/只/次。通过抗体产生进程曲线可以看出,三组BALB/c小鼠对Cd-BSA都能产生免疫应答,不同小鼠的免疫应答水平不一样,但总体的应答趋势基本一致。对三组小鼠第五次免疫后的抗血清进行性质分析,其效价从2.6×104到4.2x104不等,差异不大。经方阵滴定实验确定的三组小鼠抗原-抗体反应最佳工作条件后,采用间接竞争ELISA方法对三组小鼠抗血清进行分析,测得1号小鼠灵敏度为120ng/mL,3、4、5、6、7、8和9号小鼠灵敏度分别为200、70、59、58、155、150和167 ng/mL。选取三组小鼠中的1号、6号和8号小鼠抗血清进行特异性分析,结果显示,抗血清均对汞离子有一定的交叉反应,但是与铅、铁、铜、锌等其他参试金属离子没有交叉反应。4镉离子ELISA方法的建立与湖水中镉离子的检测选取6号小鼠的抗血清为材料,通过间接竞争ELISA分析,建立了Cd2+的间接竞争ELISA方法。采用本方法,在自来水中添加Cd2+的浓度为10-200 ng/mL时,其线性方程为y=-20.62 x+87.069（R2=0.9919）,加标回收率为85.3%-90.3%,平均为86.59%。从武汉市的三个湖泊中共采集3个样品进行Cd2+的ELISA,检测结果显示A湖中Cd2+浓度达到6.08ng/mL,与AAS分析结果的相符性为105.7%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 镉的概述
• 1.1 镉的理化性质
• 1.2 镉的危害与毒性
• 1.2.1 镉的肾脏毒性
• 1.2.2 镉的肝毒性
• 1.2.3 镉的生殖毒性
• 1.2.4 镉的免疫毒性
• 1.2.5 镉的骨骼毒性
• 1.2.6 镉的心脑血管毒性
• 1.2.7 镉的致癌作用
• 1.3 镉的限量标准
• 2 镉的检测方法
• 2.1 仪器检测方法
• 2.1.1 原子吸收光谱法
• 2.1.2 氢化物原子荧光光谱法
• 2.1.3 电感耦合等离子体质谱法
• 2.1.4 原子发射光谱法
• 2.2 免疫学检测方法
• 2.2.1 食品中常见重金属元素的免疫学检测方法
• 2.2.2 食品中Cd的免疫学检测方法
• 2.2.2.1 间接竞争ELISA免疫检测
• 2.2.2.2 一步免疫检测法
• 2.2.2.3 KinExA免疫检测法
• 2.2.2.4 荧光偏振免疫检测
• 2.3 其他检测方法
• 3 研究目的、意义、内容与路线
• 3.1 目的与意义
• 3.2 主要研究内容
• 3.3 技术路线
• 第二章 镉离子完全抗原的构建与表征
• 1 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 免疫抗原Cd-BSA与包被抗原Cd-OVA的制备
• 2.2 DTPA-BSA与DTPA-OVA的制备
• 2.3 人工抗原的表征
• 2.3.1 人工抗原中蛋白含量的测定
• 2.3.2 人工抗原中Cd含量的测定
• 2.3.3 紫外可见光谱分析
• 2.3.4 三硝基苯磺酸法分析
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.3.6 X射线吸收精细结构光谱分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 Cd-BSA（OVA）的制备
• 3.2 人工抗原的紫外-可见光谱分析
• 3.3 人工抗原中游离氨基浓度
• 3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 3.5 X射线吸收精细结构光谱分析
• 3.6 人工合成抗原摩尔比的计算
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.1.1 人工抗原的紫外光谱分析
• 4.1.2 人工抗原中游离氨基浓度分析
• 4.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 4.1.4 X射线吸收精细结构光谱分析
• 4.2 讨论
• 4.2.1 螯合剂的选择
• 4.2.2 摩尔比的计算
• 4.2.3 人工抗原的鉴定
• 第三章 抗镉多克隆抗体的制备及性质分析
• 1 材料
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 实验动物
• 1.1.3 抗原
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 几种溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 动物饲养及处理
• 2.2 免疫方法
• 2.3 抗血清的制备及分析
• 2.3.1 抗血清的分离
• 2.3.2 多克隆抗体产生进程
• 2.3.3 间接非竞争ELISA测抗体血清效价
• 2.3.4 螫合剂种类及其浓度的选择
• 2.3.5 间接竞争ELISA测定抗Cd抗血清的灵敏度
• 2.3.5.1 抗原、抗体最佳工作浓度的确定
• 2.3.5.2 间接竞争ELISA标准曲线的制作
• 2.3.6 间接竞争ELISA分析抗Cd抗血清特异性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 抗血清产生进程
• 3.2 间接非竞争ELISA检测抗体的效价
• 3.3 镉离子抗血清的间接竞争ELISA灵敏度分析
• 3.3.1 包被抗原和抗血清最佳工作浓度的选择
• 3.3.2 螯合剂浓度的选择
• 3.3.3 镉离子间接竞争ELISA的竞争抑制曲线
• 3.3.4 抗Cd抗血清特异性分析
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 免疫抗原性质对抗体产生的影响
• 4.2.2 免疫抗原的剂量
• 4.2.3 间接竞争ELISA工作条件的选择
• 第四章 镉离子ELISA方法的建立与湖水中镉离子的检测
• 1 材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 ELISA标准曲线的建立
• 2.2 加标回收率的测定
• 2.2.1 标准品的添加
• 2.2.2 水样中Cd的测定
• 2.3 环境水样中Cd的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 ELISA标准曲线
• 3.2 加标回收率的测定
• 3.3 环境水样中Cd的检测
• 4 小结与讨论
• 4.1 小结
• 4.2 讨论
• 4.2.1 ELISA检测方法的建立
• 4.2.2 实际样品的前处理
• 第五章 总结与展望
• 1 总结
• 1.1 镉离子人工抗原的合成与鉴定
• 1.2 抗镉离子多克隆抗体的制备及性质分析
• 1.3 隔离子的加标回收和实际水样的检测
• 2 展望
• 3 创新点
• 参考文献
• 致谢