论文摘要
肥胖是指人体脂肪的过量储存,其产生是由于脂肪细胞体积增大和数目增多。其中,脂肪细胞数目增多是由于脂肪组织中多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的增多,后者在一定环境因素的作用下分化为成熟的脂肪细胞。从多潜能干细胞发育成为脂肪细胞是一个多步骤的过程,包括多潜能干细胞向前脂肪细胞定向、前脂肪细胞增殖、生长抑制及前脂肪细胞的终末分化。目前的研究主要集中于从前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的终末分化过程,对于如何从多潜能干细胞向前脂肪细胞定向研究甚少。我们实验室以前的研究表明BMP4能促使C3H10T1/2多潜能干细胞定向为前脂肪细胞,Huang等发现BMP4是通过Smad及p38MAPK两条信号通路发挥作用,那么BMP家族的其他成员在C3H10T1/2向脂肪细胞系定向过程中发挥着怎样的作用呢?生长分化因子6（Gdf6,又称BMP13）是BMP家族的一员。已有研究发现Gdf6在中胚层来源的细胞的发育分化中发挥作用,如骨细胞和软骨细胞。在本课题中,我们主要研究了Gdf6对C3H10T1/2多潜能干细胞向脂肪细胞系的定向中的作用及机制。我们首先利用逆转录病毒表达系统将Gdf6基因导入C3H10T1/2多潜能干细胞,发现Gdf6能够促使C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向,并在标准脂肪细胞分化方案诱导下分化为成熟的脂肪细胞。细胞由成纤维形态变为圆形,胞浆内聚集甘油三酯,脂肪细胞特异性蛋白PPARy和422/aP2表达。Gdf6因此成为除BMP4以外能够促进多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的又一重要细胞因子。BMP受体主要可激活两条重要的信号通路,即Smad和p38MAPK信号通路。我们检测了表达Gdf6的C3H10T1/2多潜能干细胞其下游信号通路激活情况。Smad和p38MAPK信号通路均可被Gdf6激活。我们应用RNA干扰手段下调了表达Gdf6的C3H10T1/2细胞内共介导Smad即Smad4以及p38MAPK的蛋白水平,以阻断这两条信号通路。结果显示下调Smad4蛋白水平能明显抑制Gdf6引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向,p38MAPK下调以后Gdf6引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向被部分抑制,当共同转染了Smad4和p38RNAi时,Gdf6引起的定向几乎被完全抑制。以上结果表明Gdf6促进C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向依赖Smad和p38MAPK两条信号通路。为了进一步研究Gdf6在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程中作用机制,我们观察了不同类型受体在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向中的作用。首先,我们检测了C3H10T1/2多潜能干细胞内各种类型BMP受体mRNA表达水平。结果表明C3H10T1/2细胞表达Bmpr1a, Bmpr2和Acvr2a,其中Bmpr2的表达水平显著高于Acvr2a,而Bmprlb和Acvr2b则不表达。接下来,我们利用RNA干扰手段敲低Bmpr1a, Bmpr2和Acvr2a的表达。结果显示Bmpr1a下调完全抑制了Gdf6促进多潜能干细胞向前脂肪细胞定向,而Bmpr2和Acvr2a的下调能部分阻碍Gdf6引起的定向,其中Bmpr2下调后对定向的抑制更显著。当共同转染Bmpr2和Acvr2a的RNAi时,Gdf6引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向被完全抑制。这一系列结果证实了Gdf6促进多潜能干细胞向前脂肪细胞定向是通过Bmpr1a, Bmpr2和Acvr2a共同实现的。Runx1t1,又被称为ETO或MTG8,全称白血病异位基因8,最早被发现参与t（8；21）急性髓系白血病的发病。在多种人体组织,如脑、心脏、骨骼肌和脂肪组织均能检测到Runx1t1的表达。此前的研究发现Runx1t1能够抑制3T3-L1前脂肪细胞的终末分化。然而在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程中是否发挥作用尚不清楚。我们在研究中发现,在BMP4和Gdf6诱导的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程中,Runx1t1的表达均显著下调。为进一步明确Runx1t1在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程中的作用,我们构建了Runx1t1的逆转录病毒表达载体感染C3H10T1/2细胞,从而达到过表达Runx1t1的目的。结果显示,Runx1t1过表达显著地抑制Gdf6或BMP4引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向。这些结果说明Runx1t1在前脂肪细胞定向过程中发挥着负向调控作用。综上所述,我们的研究发现,Gdf6通过BMPⅠ型受体Bmpr1a以及BMPⅡ型受体Bmpr2和Acvr2a激活Smad和p38MAPK信号通路,从而促进C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向。Runx1t1的下调对于Gdf6或BMP4引起C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程是必需的。至于Runx1t1抑制定向的具体作用机制有待后续试验的进一步研究。肥胖是指人体脂肪的过量储存,表现为脂肪细胞体积增大和数目增多。其中,脂肪细胞数目增多是由于脂肪组织中多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的增多,后者在一定环境因素的作用下分化为成熟的脂肪细胞。多潜能干细胞具有多向分化潜能,在合适的诱导条件下能够分化成为脂肪细胞,肌肉细胞,骨细胞和软骨细胞。其中,从多潜能干细胞发育为成熟脂肪细胞需要经历一系列精确调控的级联过程,主要可以被划分为两个阶段：多潜能干细胞定向为前脂肪细胞；前脂肪细胞终末分化为成熟的脂肪细胞。本实验室以前的研究表明BMP4能促使C3H10T1/2多潜能干细胞定向为前脂肪细胞,这为我们研究多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向过程提供了良好的细胞模型。Tgfβ1,转化生长因子β1,Tgfβ超家族的另一成员,能够促进多种前体细胞,如C3H10T1/2多潜能干细胞,神经嵴Monc-1细胞（多潜能神经嵴干细胞）,以及已分化细胞,如巨噬细胞,分化或转分化为平滑肌样细胞,表达平滑肌细胞特异性基因。由于间充质干细胞的命运决定往往是相互平衡和制约的,诱导细胞向某一方向的定向分化常常抑制其向另一方向的发育分化。而对于多潜能干细胞命运决定的分子机制,有待进一步的研究加以阐明。Egr2,全称早期生长反应基因2,是具有锌指结构的转录因子。Egr2拥有高度保守的DNA结合结构域,能够与靶基因富含GC序列的启动子结合,调控其下游基因的表达。Egr2能够被多种细胞外信号诱导表达,如生长因子,细胞因子,低氧及细胞应激等等。Egr2在各类细胞的增殖,分化和凋亡中发挥调节作用。已有研究发现,Egr2对于后脑的发育和外周神经的髓鞘化是必需的,并且Egr2能够通过调节Ⅰ型胶原的产生参与腱的分化。另外Egr2是Tgfβ1引起的纤维化反应的下游基因,能够发挥转录激活作用促进胶原基因的表达。此外,也有研究发现,Egr2在3T3-L1前脂肪细胞终末分化的过程中通过C/EBPβ依赖和非依赖的机制发挥正向调节作用。然而,在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的过程中,Egr2发挥了什么作用目前尚无报道。我们在实验中发现,经过BMP4诱导的C3H10T1/2多潜能干细胞定向为前脂肪细胞,Egr2的表达水平明显下降。C3H10T1/2多潜能干细胞定向过程中,BMP主要激活两条重要的信号通路,Smad和p38MAPK信号通路。我们利用RNA干扰手段下调了Smad4或p38MAPK的蛋白水平,从而达到阻断BMP信号通路的目的。结果显示阻断Smad4或p38MAPK信号通路能明显恢复BMP4抑制的Egr2表达。为进一步研究Egr2在这一过程中的作用机制,我们构建了Egr2逆转录病毒表达载体,并感染C3H10T1/2细胞。结果发现,Egr2过表达显著地抑制多潜能干细胞向前脂肪细胞定向。检测平滑肌细胞分化的特异性基因发现,过表达Egr2的C3H10T1/2细胞,其平滑肌细胞特异性基因,如α-SMA,Cnn1,Sm22α,Sm22β,Srf和Myocd,mRNA表达水平明显上调,Western blotting和免疫荧光结果显示,过表达Egr2的细胞α-SMA和Cnn1蛋白水平明显高于对照组,细胞形态呈长梭形。这些结果表明,Egr2抑制C3H10T1/2细胞向脂肪细胞系的定向,促进其向发育分化为平滑肌样细胞。Tgfβ1是平滑肌细胞分化重要诱导因子。我们进一步的研究发现,Egr2能够促进Tgfβ1基因的表达,进而激活Tgfβ1/Smad3信号通路。应用Tgfβ1的中和抗体以拮抗细胞分泌的Tgfβ1,以阻断Tgfβ1信号通路。结果显示,Egr2引起的Smad3磷酸化被明显抑制,然而平滑肌细胞特异性基因,如α-SMA,Cnn1,Sm22α, Sm22β,Srf和Myocd,mRNA表达水平以及α-SMA和Cnn1蛋白水平,在加入中和抗体组和对照组并无明显差异。以上结果证明,Egr2促进C3H10T1/2细胞向平滑肌样细胞的分化是不依赖于Tgfβ1信号通路的。Egr2作为转录因子,能够直接结合目的基因的启动子并激活其转录水平。我们应用荧光报告基因实验发现,Egr2对Cnn1和Sm22a的启动子有显著的激活作用,染色质免疫共沉淀的结果也显示,Egr2能够富集到Cnn1和Sm22α基因的启动子区域。以上结果证实,Egr2发挥其促进C3H10T1/2细胞向平滑肌样细胞的发育分化是通过对平滑肌细胞特异性基因Cnnl和Sm22a的转录激活实现的。综上所述,我们的研究发现了Egr2在多潜能C3H10T1/2细胞的命运决定中发挥重要的调节作用。Egr2能够抑制多潜能C3H10T1/2细胞向脂肪细胞系的定向,而促进其向平滑肌样细胞的发育分化。