甲壳动物抗菌肽及信号转导和转录激活因子（STAT）的基因克隆与功能分析

论文摘要

甲壳纲动物是水生节肢动物中最大的群体。现今,甲壳动物的养殖与捕捞是世界上最为重要的商业活动之一。然而,水产业每年都会因为病毒和细菌引起的疾病爆发而遭受惨重的损失。基于其巨大的商业价值,对甲壳动物先天免疫反应的深入了解,并藉此来控制养殖业病害爆发是十分重要的。在本论文中,我们对两种甲壳动物抗菌肽家族（甲壳肽和抗脂多糖因子）的成员进行了研究,以分析其生物学活性与功能。此外,我们还在中国明对虾中克隆得到了信号转导和转录激活因子,并对它的表达模式进行了研究。1.中国明对虾甲壳肽类抗菌肽的性质研究实验室的前期工作中得在中国明对虾中得到了三个甲壳肽家族成员,命名为Fc-crus1、Fc-crus 2和Fc-crus 3。在本论文中,我们对这3个甲壳肽的cDNA序列和演绎的氨基酸序列进行了序列特征分析。结构表明,Fc-crus 2和Fc-crus 3演绎的氨基酸序列中均含有一个信号肽,C-端有一个由12个保守的半胱氨酸组成的甲壳肽结构域；现已得到的Fc-cru 1部分序列也包含甲壳肽结构域。系统进化树分析显示,来源于十足目动物中的含WAP结构域的蛋白可分为3大组：甲壳肽,carcinin和含有单／双WAP结构域的蛋白。Fc-crus 1和Fc-crus 2属于甲壳肽组,而Fc-crus 3属于carcinin组。据我们所知,Fc-crus 3是对虾中发现的第一个carcinin样蛋白。不同发育阶段的表达模式显示,Fc-crus 1和Fc-crus 2在检测的各发育阶段均有表达,而Fc-crus 3的转录本仅在成虾的卵巢中检测到,在无节幼体、糠虾幼体、后期幼体,以及幼虾的卵巢中均没有检测到表达。我们在大肠杆菌中分别重组表达了Fc-crus 2和Fc-crus 3的成熟肽序列并纯化。抗菌实验显示纯化的重组蛋白mFc-crus 2能够在体外抑制革兰氏阳性菌的生长。2.克氏原螯虾抗脂多糖因子的性质研究我们在克氏原螯虾中得到了两条抗脂多糖因子的cDNA序列,并分别命名为PcALF1和PcALF2。这两个PcALF演绎的氨基酸序列较为保守,均具有信号肽和脂多糖结合结构域,特别需要注意的是在脂多糖结合结构域的两端各具有1个保守的半胱氨酸残基。RT-PCR结果显示PcALF1和PcALF2的转录本在多个组织中都能检测到表达。实时定量PCR的结果显示,PcALF1和PcALF2的表达水平都受到病毒、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的上调。纯化的重组蛋白PcAFL1表现出多种生物学活性：它能够与检测的各种细菌和真菌结合；还能够与微生物多糖（脂多糖、脂磷壁酸、β-葡聚糖）结合。体外的液体抑菌实验的结果显示PcALFl具有广谱抗菌的活性,能够抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。此外,重组表达的PcALF1在体内具有清除鳗弧菌的活性,且这种活性表现为剂量依赖性。3.中国明对虾信号转导和转录激活因子基因克隆与表达模式研究先天免疫是宿主抵御入侵病原的第一道防线,多条信号转导途径参与到宿主的免疫反应中,Janus激酶／信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）途径就是其中之一。诸多实验证据已经证明JAK/STAT信号途径参与宿主的抗菌和抗病毒免疫反应。我们在中国明对虾中克隆得到的了信号转导和转录激活因子（命名为FcSTAT）的cDNA序列和基因组序列。系统进化树分析显示FcSTAT与脊椎动物中的STST5和STAT6,以及无脊椎动物中的STAT分为一组。实时定量PCR显示FcSTAT在检测的各个组织和各发育阶段均有表达。受到WSSV刺激后不同时间段的表达模式显示,在血细胞、肝胰腺和肠中FcSTAT在感染的早期均表现出明显的上调表达。在受到鳗弧菌刺激后,FcSTAT在血细胞和肝胰腺中也上调表达。所有这些数据均显示JAK/STAT信号途径参与中国明对虾的抗细菌和抗病毒的免疫反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一部分 综述:无脊椎动物的先天免疫
• 第一章 无脊椎动物的先天免疫
• 一、细胞免疫
• 1. 血细胞的分类
• 2. 吞噬作用
• 3. 调理作用
• 4. 包被作用与结节形成
• 二、体液免疫
• 1. 凝结
• 2. 酚氧化酶原系统与黑化反应
• 3. 抗菌肽
• 三、无脊椎先天免疫反应的主要信号途径
• 1. Toll途径
• 2. Imd途径
• 3. JAK/STAT途径
• 第二章 无脊椎动物抗菌肽的研究
• 一、抗菌肽的结构特点
• 二、抗菌肽的作用方式
• 三、抗菌肽的合成部位与表达分布
• 四、抗菌肽的分类
• 1. 具有两亲结构的线性α-螺旋抗菌肽
• 2. 由一个或是多个二硫键形成的环状多肽
• 3. 富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽
• 五、甲壳动物抗菌肽研究进展
• 1. 抗脂多糖因子
• 2. 含WAP结构域蛋白
• 3. 溶菌酶
• 第三章 论文的研究目的及内容
• 一、研究目的及意义
• 二、研究内容及技术路线
• 第二部分 甲壳动物抗菌肽性质与功能研究
• 第一章 中国明对虾甲壳肽类抗菌肽的性质研究
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 1. 材料
• 1.1. 实验材料
• 1.2. 菌株和载体
• 1.3. 试剂和仪器
• 2. 方法
• 2.1. 序列分析
• 2.2. 血细胞的分离
• 2.3. 总RNA的提取
• 2.4. 第一链cDNA合成
• 2.5. 半定量RT-PCR
• 2.6. 重组表达
• 2.7 最小抑菌浓度测定
• 三、结果
• 1. 序列分析
• 2. 不同发育阶段的表达模式
• 3. 重组表达与纯化
• 4. 抑菌活性检测
• 四、讨论
• 第二章 克氏原螯虾抗脂多糖因子的性质研究
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 1. 材料
• 1.1. 菌株,病毒和载体
• 1.2. 实验材料
• 1.3. 试剂和仪器
• 2. 方法
• 2.1. 免疫刺激
• 2.2. 血细胞的分离与组织提取
• 2.3. 总RNA的提取与第一链cDNA合成
• 2.4. 序列分析
• 2.5. 半定量RT-PCR及Real time-PCR
• 2.6. 重组表达及抗体制备
• 2.7. Western blot
• 2.8. 菌结合实验
• 2.9. 多糖结合实验
• 2.10. 抗菌活性检测
• 2.11. 体内清除实验
• 三、结果
• 1. 基因克隆及序列分析
• 2. 组织分布及表达模式
• 2.1. 组织分布
• 2.2. 病原刺激后的表达模式
• 3. PcALF1的重组表达与纯化
• 4. rPcALF1菌结合活性
• 5. rPcALF1与生物多糖的结合活性
• 6. rPcALF1的抗菌活性
• 7. 体内清除鳗弧菌实验
• 四、讨论
• 第三部分 中国明对虾信号转导和转录激活因子基因克隆与表达模式研究
• 一、前言
• 二、材料和方法
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1. 免疫刺激、总RNA的提取与第一链cDNA合成
• 2.2. 中国明对虾STAT基因的克隆
• 2.3. FcSTAT基因组序列的克隆
• 2.4. 序列分析
• 2.5. Real time-PCR
• 三、结果
• 1. FcSTAT cDNA序列克隆与分析
• 2. FcSTAT基因结构
• 3. FcSTAT组织分布与表达
• 4. 免疫刺激后FcSTAT的表达模式
• 5. FcSTAT在不同发育阶段的表达模式
• 四、讨论
• 总结与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表文章
• 附件
• 学位论文评阅及答辩情况表