甲基营养型菌株WGP35的筛选、鉴定及突变sdaA基因对其产L-丝氨酸的影响

论文摘要

甲基营养菌在自然界中的分布非常的广泛,它们具有独特的一碳代谢途径,能够将自然界中取之不尽的一碳化合物如甲醇、甲醛等转变为菌体自身所需的营养物质,同时又会产生多种有益的代谢副产物L-丝氨酸、维生素B12、聚β羟基丁酸盐等。因此,深入研究甲基营养菌具有重要的意义。L-丝氨酸是一种具有重要作用的氨基酸,被广泛应用于制药、食品、饲料、化妆品、农业等方面。全球每年L-丝氨酸的需求量很大,但L-丝氨酸的工业化生产却很难。目前主要利用微生物发酵法生产L-丝氨酸。本实验从不同的环境中筛选到三株不同的甲基营养型菌株WGP35、WGP07、WGM16。通过对菌株的16S rDNA（?）序列分析、形态学观察及生理生化鉴定,将菌株WGP07归为副球菌（Paracoccus）,菌株WGM16归为甲基杆菌（Methylobacterium）,菌株WGP35归为假单胞菌（Pseudomonas）。三株菌都能够利用甲醇生产L-丝氨酸。其中菌株WGP35的L-丝氨酸产量最高为2.5mg/ml。sdaA基因编码的丝氨酸脱水酶（L-SerDH）催化L-丝氨酸降解为丙酮酸,是影响L-丝氨酸产量的关键因素。在本实验中突变菌株WGP35的sdaA基因,研究其对菌株产L-丝氨酸的影响。根据GenBank中Pseudomonas putida GB-1中的sdaA基因序列设计引物,PCR扩增sdaA的同源序列。测序结果发现与Pseudomonas putida GB-1中的sdaA基因序列在核苷酸水平上有90%的同源性。利用自杀质粒PK18mob对菌株WGP35中的sdaA基因进行定点突变,构建突变菌株WGP35TB。突变菌株WGP35TB表现为L-丝氨酸营养缺陷型。sdaA基因突变后突变菌株较野生菌株比其L-丝氨酸的产量提高了16%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 甲基营养菌简介
• 1.1.1 甲基营养菌的分类
• 1.1.2 甲基营养菌的一碳同化途径
• 1.1.3 甲基营养菌的生活习性
• 1.1.4 甲基营养菌的应用
• 1.1.5 国内外甲基营养菌的研究进展
• 1.2 L-丝氨酸的作用
• 1.2.1 L-丝氨酸的生产现状
• 1.2.2 L-丝氨酸的生产方法
• 1.2.3 利用添加前体物发酵产L-丝氨酸的菌株
• 1.2.4 影响L-丝氨酸产量的因素
• 1.2.5 sdaA基因编码的丝氨酸脱水酶
• 1.3 选题的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验所用的材料
• 2.1.1 试验样品来源
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.2 菌株生长所需的培养基、生长条件、保存方法
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 菌株培养条件
• 2.2.3 菌株保存
• 2.3 抗生素及其浓度
• 2.4 常用溶液和缓冲液及其配制方法
• 2.5 菌株形态学和生理生化鉴定
• 2.5.1 革兰氏染色
• 2.5.2 类脂粒
• 2.5.3 氧化酶试验
• 2.5.4 接触酶试验
• 2.5.5 糖、醇类发酵
• 2.5.6 甲基红（M.R）、V-P试验
• 2.5.7 淀粉水解
• 2.5.8 纤维素水解
• 2.5.9 七叶灵水解
• 2.5.10 3-酮基乳糖测定
• 2.5.11 硝酸盐还原试验
• 2.5.12 反硝化试验
• 2.5.13 脲酶试验
• 2.5.14 吲哚试验
• 2.5.15 精氨酸双水解酶试验
• 2.5.16 明胶液化试验
• 2.5.17 脂酶试验
• 2.5.18 硫化氢试验
• 2.5.19 牛奶水解试验
• 2.5.20 菌株生长条件检测
• 2.5.21 抗性验证试验
• 2.5.22 碳源利用情况
• 2.5.23 DNA G+Cmol%含量测定
• 2.6 基因组DNA的提取
• 2.7 质粒DNA的提取
• 2.8 琼脂糖凝胶电泳
• 2.9 DNA的酶切
• 2.10 DNA纯化
• 2.10.1 胶回收纯化
• 2.10.2 PCR产物纯化
• 2.11 DNA的连接
• 2.12 DNA的化学转化
• 2.12.1 感受态细胞的制备
• 2.12.2 转化
• 2.13 三亲本结合
• 2.14 发酵L-丝氨酸的静息细胞体系
• 第三章 甲基营养型菌株的分离筛选
• 3.1 取样时间与地点
• 3.2 甲基营养型菌株的分离筛选
• 3.2.1 初筛
• 3.2.2 复筛
• 3.3 菌株WGP07和WGM16的甲醇降解情况
• 3.3.1 菌株WGP07的甲醇降解情况
• 3.3.2 菌株WGM16的甲醇降解情况
• 3.4 WGP07、WGM16和WGP35的形态观察
• 3.4.1 WGP07的形态特征
• 3.4.2 WGM16的形态特征
• 3.4.3 WGP35的形态特征
• 3.5 菌株WGP07、WGM16和WGP35的生长情况
• 3.5.1 菌株WGP07的生长情况
• 3.5.2 菌株WGM16的生长情况
• 3.5.3 菌株WGP35的生长情况
• 3.6 小结
• 第四章 甲基营养型菌株WGP07、WGM16、WGP35的鉴定
• 4.1 菌株WGP07、WGM16和WGP35的分子生物学分析
• 4.1.1 PCR扩增菌株16S rDNA
• 4.1.2 PCR产物与PMD18-T载体的连接与转化
• 4.1.3 16S rDNA PCR产物的测序结果与分析
• 4.2 菌株WGP07、WGM16和WGP35的碳源利用情况
• 4.2.1 菌株WGP07的碳源利用情况
• 4.2.2 菌株WGM16的碳源利用情况
• 4.2.3 菌株WGP35的碳源利用情况
• 4.3 菌株WGP07基因组DNA G+Cmol%含量及细胞脂肪酸含量检测
• 4.3.1 基因组DNA G+Cmol%含量
• 4.3.2 全细胞脂肪酸含量
• 4.4 菌株WGP35、WGP07、WGM16的生理生化性质
• 4.4.1 菌株基本性状
• 4.4.2 抗性研究
• 4.4.3 碳源利用情况
• 4.4.4 菌株WGP07、WGM16、WGP35生化性质
• 4.4.5 菌株WGP07、WGM16、WGP35 L-丝氨酸生产情况
• 4.5 小结
• 第五章 突变sdaA基因对菌株WGP35产L-丝氨酸的影响
• 5.1 WGP35中sdaA基因的克隆
• 5.2 sdaA基因与pMD18-T载体的连接与转化
• 5.3 sdaA基因测序结果的分析
• 5.3.1 sdaA基因核苷酸序列分析
• 5.3.2 sdaA基因编码的氨基酸序列分析
• 5.3.3 sdaA基因编码的丝氨酸脱水酶的蛋白质功能结构域
• 5.4 sdaA基因突变体的构建
• 5.4.1 sdaA基因部分片段的扩增
• 5.4.2 sdaA基因部分片段与PK18mob连接
• 5.4.3 PK18mob-psdaA重组质粒验证正反向
• 5.4.4 三亲本结合
• 5.4.5 sdaA基因突变体的验
• 5.5 菌株生长情况分析
• 5.5.1 菌株对不同碳源的利用情况
• 5.5.2 菌株生长曲线
• 5.6 菌株产L-丝氨酸情况分析
• 第六章 总结与讨论
• 6.1 菌株WGP35的特性
• 6.2 菌株WGP07的特性
• 6.3 菌株WGM16的特性
• 6.4 突变sdaA基因对菌株产L-丝氨酸的影响
• 6.5 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录一
• 攻读硕士学位期间发表论文情况