论文摘要
猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2,SS2）是一种重要的人兽共患病病原菌,可感染猪等多种动物和人,并具有强致死性。SS2不同强毒株之间的致病性存在差异。SS2可分为强毒株、弱毒株和无毒株。目前的研究认为SS2可能的毒力因子主要包括荚膜多糖（CPS）、胞外因子（EF）、溶菌酶释放蛋白（MRP）和溶血素（Sly）等,但它们在致病中的作用还不清楚。研究发现,有的SS2分离株虽然没有EF、MRP和SLY等毒力因子,但也具有很强的致病性;有的分离株虽然具有这些毒力因子,反而致病力较弱。因此认为SS2可能还有其它未知的毒力因子存在。为了寻找SS2的毒力因子,我们从SS2强毒株与无毒株基因组之间的差异入手,采用抑制性消减杂交方法（Suppression subtractive hybridization,SSH）构建差异文库,研究强毒株与无毒株之间的遗传差异。利用抑制消减杂交技术,获得SS2强毒株特异性片段共42条。根据差异片段所在ORF的情况分析发现可能与SS2致病性相关的毒力因子有MRP、EF、Sly、耐药基因（drug-resistance gene）、I型限制酶修饰系统（ Type I restriction-modification system）、表面锚定蛋白（ LPXTG-motif cell wall anchor domain protein ）和毒力相关蛋白E（Virulence-associated protein E,VapE）等。通过片段在基因组上的定位,发现有六个分布相对比较集中的区域,为毒力岛的确定提供了新的证据。构建的SS2强毒株与国际参考无毒株的基因组差异文库及其生物学信息分析数据为进一步发掘SS2可能的毒力因子奠定了基础。为了研究SS2基因组中virulence-associated protein E（vapE）基因在细菌致病性中的作用,利用DNA同源重组的原理,通过温敏型自杀性重组质粒,以SS2中国流行强毒株458#为研究对象,定点敲除SS2基因组中vapE基因,构建了SS2 VapE缺失株（458#△vapE）。实验结果表明,所构建的458#△vapE菌株基因组中vapE定点缺失位点正确。利用家兔SS2感染模型,并以458#始发强毒株作对照,研究458#△vapE的致病性。实验结果显示,458#强毒株腹腔接种109CFU,可在3d内致死家兔,并呈现典型临床症状及组织病理学变化,而458#△vapE以同样方式相同剂量接种家兔,实验家兔存活,未表现明显的临床症状,各组织器官未见解剖病理学变化。该研究结果证实,SS2中VapE是构成细菌致病性的重要因子,在细菌对家兔的致死性上起重要作用。为了研究SS2基因组中是否存在致病岛及其在细菌致病性上的作用,根据已有的SS2基因组序列提供的生物学信息合成了一对引物,用于基因岛的扩增,扩增位置从05ZYH33基因组中第833,665个碱基起始,终止于第846,692个碱基,共计13027bp。而从国际参考无毒株1330#扩增到一段长度约为1.7kb的序列,测序后经序列比对证明了1330#相对于强毒株在基因组上存在一段长约11kb的缺失,对应于05ZYH33中从第834,907个碱基至第846,210个碱基。通过对这段缺失的基因群的结构分析显示,该基因群具有与基因转移相关的重组酶、低G+C含量和明确的旁侧整合位点等特点,而且所检测的SS2无毒菌株精确缺失此基因群,表明它可能是新发现的致病岛,命名为PAI4。为了进一步研究PAI4的功能,我们以中国流行强毒株458#为始发菌株,通过基因敲除来研究敲除突变后菌株的表型差异。结果利用同源重组技术对458#的PAI4进行定点缺失突变。家兔的感染实验表明缺失了PAI4的458#△PAI4对家兔不具有致死性,说明PAI4在SS2的致病过程中起着关键作用。