新型噻唑烷酮化合物抗脑胶质瘤的活性及其作用机制研究

论文摘要

恶性肿瘤严重危害人类的健康,脑胶质瘤是常见的恶性肿瘤之一,神经胶质瘤发生率占神经系统原发性肿瘤的78%,发病人群集中在青少年,复发率较高,治愈率低。药物治疗是目前临床治疗脑癌的主要手段之一。寻找和研发高效低毒的化疗药物,是当代医学和药学的重要研究课题。噻唑烷酮化合物因其具有广谱的抗癌活性和独特的生理活性低毒性而日益受到人们重视。目的：从先期合成的噻唑烷酮类化合物库中筛选出对人胶质瘤细胞具有细胞毒性的化合物,其中ZHY-206 （HBPT,2-（2-苯醚基亚胺基）-5-（2-羟基-苯亚甲基）-1,3-噻唑-4-酮）活性较好,本课题通过对其体外抗脑癌活性以及体内对荷瘤小鼠的抗肿瘤活性的研究,从细胞水平探讨其抗肿瘤作用机制,并考察HBPT的急性毒性,为研发噻唑烷酮化合物HBPT作为新型抗脑胶质瘤化疗药物提供实验依据。方法：体外采用SRB法评价HBPT抑制人脑胶质瘤U87MG细胞增殖；观察HBPT对小鼠的急性毒性,建立小鼠皮下移植瘤模型,观察HBPT对人脑胶质瘤的实验治疗作用；应用流式细胞术的方法检测HBPT对胶质瘤细胞的凋亡率和分析细胞周期的改变；应用免疫荧光和微管聚合实验检测化合物对微管的作用；应用体外激酶筛选实验研究化合物的激酶作用靶点。结果：1.SRB法实验结果表明：噻唑烷酮化合物HBPT对体外培养的U87MG细胞增殖有较好的抑制作用,48h后U87MG细胞的IC50值约为20μM。对荷瘤小鼠的抗肿瘤实验结果显示,HBPT对脑胶质瘤有良好的实验治疗作用,经腹腔注射连续给药两周后,40 mg/kg/day、60 mg/kg/day治疗组的抑瘤率分别为：63.61%和73.16%,瘤重与阴性对照组比较均有明显的显著性差异（P<0.01）。2.与溶剂对照组比较,噻唑烷酮化合物HBPT对荷瘤小鼠的造血系统、组织器官均无明显差异（P>0.05）,体重无明显下降。相对于化疗药物TMZ（替莫唑胺）10 mg/kg/day, HBPT抑瘤率较高,体现出一定的优势。3.流式细胞仪检测分析表明,HBPT能诱导U87MG肿瘤细胞发生凋亡,24 h、48 h早期凋亡占10%左右,细胞周期被阻滞在G2/M期,作用48h后处于G2/M期细胞占总细胞数的50%左右。电镜下观察,HBPT作用于U87MG细胞引起细胞自噬现象的发生,体外实验结果表明自噬在HBPT对U87MG细胞作用过程中保护癌细胞,蛋白质印迹试验表明细胞内自噬相关蛋白的表达水平上升。4.免疫荧光和体外微管聚合实验证明HBPT可以抑制微管的聚集,呈剂量时间依赖性；激酶筛选实验表明化合物HBPT抗肿瘤作用不以激酶为靶标。5.急性毒性试验表明HBPT无明显的急性毒性,对BALB/c小鼠的口服最大剂量（MTD）≥400mg/kg,静脉注射MTD≥60 mg/kg。结论：噻唑烷酮化合物HBPT在体内外均能有效抑制人脑胶质瘤的生长,且无造血器官毒性作用,无明显急性毒性。HBPT可抑制细胞内微管聚集,将细胞阻滞在G2/M期,进而诱导细胞凋亡。HBPT对U87MG细胞作用过程引起细胞自噬,体外实验中自噬起保护细胞的作用。HBPT的抗肿瘤活性不以激酶作为抗癌作用靶点。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 神经胶质瘤概述
• 1.1.1 神经胶质瘤的介绍
• 1.1.2 多形型脑胶质瘤的特点
• 1.2 细胞周期
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 细胞周期的调控
• 1.2.3 细胞周期检验点
• 1.2.4 细胞周期调控和肿瘤的发生
• 1.3 细胞的死亡和细胞凋亡
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 细胞凋亡的特征
• 1.4 细胞内的信号传导
• 1.4.1 RAS-RAF-MEK-ERK（MAPK）通路
• 1.4.2 PI3K/AKT信号通路
• 1.4.3 PKC信号传导通路
• 1.5 脑神经胶质瘤治疗研究进展
• 1.5.1 手术
• 1.5.2 放疗
• 1.5.3 化疗
• 1.6 噻唑烷酮类化合物抗癌活性的研究进展
• 1.6.1 噻唑烷酮类化合物概况
• 1.7 本课题的研究内容和意义
• 第二章 噻唑烷酮化合物HBPT的体外抗癌效应研究
• 2.1 主要试剂与材料
• 2.2 主要实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细胞的培养
• 2.3.2 细胞存活率的检测方法
• 50的求算'>2.3.3 GI₅₀的求算
• 2.3.4 台盼蓝染色检测
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 噻唑烷酮化合物抑制U87MG细胞的增殖
• 2.4.2 HBPT对U87MG细胞毒性作用
• 2.5 结论
• 第三章 HBPT的体内抗肿瘤效应研究
• 3.1 主要试剂与材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 实验试剂
• 3.2 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 裸鼠人U87MG异体移植瘤模型的建立
• 3.3.2 化合物HBPT体内毒副作用观察
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 体内抗瘤活性
• 3.4.2 体内毒副作用
• 3.5 结论
• 第四章 HBPT抗癌机理的初步探讨
• 4.1 主要试剂与材料
• 4.2 主要实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 细胞凋亡的检测
• 4.3.2 细胞周期的检测
• 4.3.3 细胞自噬的检测
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 细胞凋亡的发生
• 4.4.2 细胞周期的阻滞
• 4.4.3 细胞自噬的发生
• 4.5 结论
• 第五章 HBPT抗癌作用靶点的初步确认
• 5.1 主要试剂与材料
• 5.2 主要实验仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 免疫荧光检测
• 5.3.2 微管聚合实验检测
• 5.3.3 KINOME scan激酶筛选
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 HBPT抑制细胞内微管的聚集
• 5.4.2 噻唑烷酮类化合物HBPT体外抑制微管聚合
• 5.4.3 激酶实验
• 5.5 结论
• 第六章 HBPT急性毒性试验
• 6.1 材料与仪器
• 6.1.1 实验动物
• 6.1.2 实验材料
• 6.1.3 主要实验仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 最大耐受剂量（MTD）试验
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 一般症状及死亡情况
• 6.3.2 体重及脏器指数情况
• 6.3.3 血液生化检测结果
• 6.3.4 脏器HE染色病理切片分析结果
• 6.4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间公开发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表