论文题目: 大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖机制研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 内科学
作者: 王翔飞
导师: 葛均波
关键词: 大黄素,血管平滑肌细胞,凋亡,活性氧,氧化酶,损伤,细胞色素酶,分布,细胞老化,细胞自噬,甲囋
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 第一部分大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖机制研究背景:大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基葸醌)是天然蒽醌化合物,可以抑制多种肿瘤细胞增生。然而,大黄素对平滑肌细胞的作用机制研究甚少。大黄素能够促进肿瘤细胞(Mahlavu,HL-60)凋亡,Mahlavu细胞凋亡现象可被抗氧化剂(过氧化氢酶和环孢霉素A)部分阻断,但是HL-60细胞凋亡现象不能被抗氧化剂所阻断,因此ROS途径是否参与大黄素诱导细胞凋亡存在争议。大黄素在细菌中常有致突变效应(mutagenicity),在细胞中常有基因毒性(genotoxicity)。DNA损伤促进p53表达,p53途径活化后既可以抑制细胞生长,又可促进细胞凋亡。ROS途径和p53途径是大黄素发挥作用的可能途径。大黄素可被细胞色素P450代谢酶(CYP)代谢转化为2-羟基大黄素,它抑制增殖效果强于大黄素。CYP抑制剂或者诱导剂可能改变大黄素作用特点。方法:人血管平滑肌细胞(VSMCs)培养于M1 99培养液中。通过细胞计数、MTT法、细胞周期、细胞迁移等方法观察大黄素的作用特点。使用Annexin V和7-AAD双染法、乳酸脱氢酶释放来观察大黄素促VSMCs死亡的方式。对于ROS途径,利用ROS生成阻断剂观察大黄素促ROS生成途径,并观察ROS强度降低后VSMCs死亡方式的变化。对于p53途径,采用p53蛋白印迹、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜进行观察。使用CYP阻断剂和诱导剂观察大黄素作用特点(抑制VSMCs增殖、促进ROS)是否发生变化。利用基因芯片观察上述信号通路基因转录水平的变化。结果:(1)低浓度大黄素(3-1、6.3μg/ml)抑制VSMCs增殖,高浓度大黄素(25.0μg/ml)促进VSMCs死亡。GOG1期细胞呈大黄素浓度依赖性增多,而S期细胞则显著减少,25μg/ml大黄素组S期细胞较正常对照组减少达80%(7.40±1.65%vs.39.05±5.88%,p<0.05)。不同浓度大黄素均可抑制VSMCs迁移,25μg/ml抑制率为89.6%(p<0.05)。(2)大黄素以持续稳定的方式促进细胞内ROS生成(r=0.97,p<0.01),NADPH氧化酶抑制剂(DPI或PDTC)可以抑制大黄素促ROS效应,而其他抑制剂(CsA、ABT、α-NF)则无抑制效果。细胞内抗氧化能力并无明显变化。大黄素促使VSMCs凋亡和坏死,以凋亡为主。DPI可以显著阻断200μM过氧化氢诱导的VSMCs坏死和凋亡(凋亡:12.6±0.98%vs.4.0±1.00%,p<0.05,坏死:32.2±2.99%vs.4.87±2.22%,p<0.05),也能显著阻断大黄素促VSMCs凋亡(14.55±2.29%vs.8.77±0.83%,p<0.05),对坏死并无明显影响(1.18±0.14%vs.1.25±0.28%。p>0.05)。乳酸脱氢酶活性测定显示大黄素促进VSMCs坏死,可被DPI轻微减轻。(3)大黄素干预后细胞出现非计划性DNA合成(DNA损伤修复标志)。DNA修复基因表达增强。p53蛋白表达也上调(25μg/ml大黄素组较对照组高1.69倍,p<0.05)。透射电子显微镜显示细胞核中异染色质增多。DPI未影响大黄素的UDS现象。(4)激光共聚焦显示大黄素能迅速渗透进入细胞内部,但在细胞内的分布呈明显的选择性:绝大多数大黄素分布于细胞浆中,仅有少量分布于细胞核内。(5)CYP抑制剂(ABT、α-NF)或者诱导剂(3-MC、β-NF)对大黄素抑制VSMCs增殖和促ROS生成效应均无明显影响。(6)大黄素呈浓度和时间依赖性促进VSMCs老化。我们还观察到大黄素干预后VSMCs自噬的现象。结论:(1)低浓度大黄素抑制VSMCs增殖,高浓度促进VSMCs死亡。(2)ROS途径和p53途径是大黄素发挥效应的两个主要途径,ROS是大黄素促细胞凋亡效应的主要参与者,p53途径主要参与抑制细胞增殖,也涉及细胞凋亡。(3)培养的平滑肌细胞中没有CYP表达,大黄素自身发挥作用,而非代谢产物。第二部分MTT法用于测定大黄素细胞毒性作用的效果背景:MTT法被广泛用于测定药物的细胞毒性作用,但其特异性和敏感性也可以受一些因素的影响,如有颜色物质。我们将探索大黄素自身是否也是干扰因素。方法:血管平滑肌细胞培养于M199培养液中。使用分光光度计测定大黄素和甲(?)的吸光度(O.D.)。结果:在不同溶剂中,大黄素具有不同的吸收光谱。溶剂中存在水分时吸收光谱将向右移,与甲(?)的吸收光谱明显重叠。大黄素呈浓度依赖性直接将MTT还原为甲(?),大黄素的还原能力可被血清显著抑制。大黄素在细胞内含量非常微弱且其代谢转化非常缓慢。结论:大黄素可以干扰MTT法的准确性,改良后的MTT法可用于评价大黄素的细胞毒性。
论文目录:
摘要
Abstract
前言
第一部分 大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖机制研究
前言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
第二部分 MTT法测定大黄素细胞毒性作用的效果
前言
材料和方法
结果
讨论
参考文献
综述:大黄素的基因毒性和基因突变性能
综述:大黄素抑制细胞增殖、促进细胞死亡机理
致谢
发布时间: 2007-06-28
参考文献
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