论文摘要
研究背景及目的原发性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是临床上常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内其发病率居恶性肿瘤的第五位。目前肝癌的发病率呈明显上升趋势,据最新统计,全世界每年新发肝癌患者约62.5万。尽管近年来越来越多的肝癌患者能够被早期发现并行手术治疗,但肝癌患者的死亡率仍居高不下,全世界每年因肝癌引起的死亡人数约60万,仅次于胃癌与食管癌占全球癌症死亡原因的第3位。我国肝癌发病率居世界之首,发病人数约占全球肝癌发病人数的55%。由于缺乏有效的治疗手段,使得肝癌成为我国第2位癌症杀手。因此,肝癌严重威胁我国人民的健康和生命。肝癌的发生发展是一个多步骤、渐进式的过程,在这个过程中伴随着许多抑癌基因与癌基因表达调控的紊乱,如PTEN、P53等抑癌基因的失活或表达量降低,GPC3、TGF-β1等癌基因的激活或表达量的增加。尽管如此,这些基因仍不能作为肝癌早期诊断和预后判断的分子标志物。因此,寻找肝癌早期诊断、预后判断、确定治疗决策的分子标志物及研究肝癌发病的分子机制仍是肝癌研究的重要内容。泛素结合酶E2T （ubiquitin-conjugating enzyme E2T, UBE2T）,是泛素结合酶E2家族成员之一,具有一个特征性的大小约1618kDa的保守结构域一泛素结合（UBC）结构域,且具有C末端延伸序列,属第二类泛素结合酶。UBE2T是范可尼通路（Fanconi anemia pathway, FA）的重要组成成员,DNA的损伤可以激活FA通路,该通路被激活后,首先泛素激活酶（E1酶）将泛素分子传递给泛素结合酶UBE2T;然后UBE2T将泛素分子传递给FA通路中的核心复合体（包括FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、FANCM）;之后核心复合体可以将泛素分子传递给FANCD2,使FANCD2发生单泛素化；最后单泛素化的FANCD2靶向细胞核聚集点,进而修复损伤的DNA（图1）。越来越多的研究指出,泛素结合酶E2,作为泛素-蛋白酶系统中的重要成员之一,与细胞的增殖、凋亡、肿瘤的发生发展等密切相关。最早Takata等发现UBE2T在膀胱癌、肺癌、前列腺癌组织中表达上调。之后Yuichi等发现UBE2T可通过调节FANCD2的单泛素化水平,影响细胞的DNA损伤修复途径,引起肿瘤的发生。近年来研究表明,UBE2T作为一个肿瘤相关基因在多种肿瘤的发生发展中起到了重要的调控作用,如UBE2T在肺癌组织中表达增高,过表达UBE2T的肺癌细胞克隆形成能力显著增高,提示UBE2T的表达上调与肺癌的发生密切相关；下调UBE2T的表达或抑制其活性,可阻断BRCA1的降解,从而抑制乳腺癌细胞的增殖；在乏氧条件下,UBE2T表达下调可增加肿瘤细胞的化疗敏感性。这些结果提示,UBE2T作为一个致癌基因,参与到多种肿瘤的发生发展过程中。本研究首先应用组织芯片技术与免疫组织化学技术分析了UBE2T在消化系统恶性肿瘤组织中的表达水平的变化,探讨其在消化系统肿瘤中的表达意义。然后从基因与蛋白水平重点分析了其在肝癌中的表达水平的变化,明确了UBE2T对肝癌患者预后的影响,阐明了其在肝癌发生发展过程中的作用及对肝癌侵袭转移的影响及作用机制,为进一步寻找肝癌早期诊断、预后判断、确定治疗决策的新的分子标志物及靶向治疗提供了理论依据。方法1、消化系统肿瘤中UBE2T表达水平的分析应用购自西安艾丽娜生物科技有限公司消化系统组织芯片,共96点,包括恶性肿瘤37例（食道癌、胃癌和结肠癌各7例,肝癌6例,直肠癌4例,小肠癌5例,胆管癌1例）和11例正常组织（食道、胃、肝、结肠和直肠组织各2例,小肠组织1例）。其中女性15例,男性33例,年龄22～79岁,平均（50.87±13.534）岁,所有肿瘤分类均以WHO标准分类,经病理证实。应用免疫组织化学技术检测各消化系统肿瘤中UBE2T的表达水平的变化。采用两独立样本非参数检验方法对免疫组化评分结果进行统计学分析,比较肿瘤组织及正常组织的UBE2T表达水平有无差异。2、肝癌中UBE2T表达水平的表达水平的分析利用免疫组织化学技术检测133例原发性肝癌石蜡组织标本中UBE2T的表达水平,并对UBE2T表达水平进行评分,应用Kaplan-Meier生存分析法分析UBE2T对肝癌预后的影响；采用Spearman秩相关分析UBE2T表达与原发性肝癌各临床病理参数之间的相关性；运用COX比例风险回归模型对各临床病理参数、UBE2T表达与原发性肝癌预后的关系进行单因素与多因素分析,明确UBE2T是否可以作为原发性肝癌发病的独立风险因素。Real time-PCR的方法检测30对原发性肝癌组织及其癌旁组织中UBE2T mRNA表达水平,验证其表达水平有无差异；Western blot检测26对原发性肝癌组织及其癌旁组织中UBE2T蛋白水平的表达,进一步明确UBE2T是否在原发性肝癌组织中高表达。3、UBE2T在肝癌细胞中的生物学作用及影响肝癌侵袭转移的机制Real time-PCR检测在各肝癌细胞株中UBE2T mRNA的表达,Western blot检测肝癌细胞株中UBE2T蛋白的表达。用UBE2T高表达细胞株,利用siRNA将UBE2T干扰,Transwell检测肝癌细胞侵袭转移能力的变化；将UBE2T低表达细胞株,转染UBE2T过表达质粒pEGFP2-UBE2T,荧光显微镜观察转染效率,G418筛选阳性克隆,Transwell检测UBE2T过表达后肝癌细胞侵袭转移能力的变化。将UBE2T过表达或干扰后,Western blot检测与肝癌EMT相关蛋白表达量的变化。结果1、消化系统肿瘤中UBE2T表达水平的分析组织芯片免疫组化结果显示UBE2T在消化道多种肿瘤组织中表达普遍增高,在37例不同肿瘤组织中阳性率高达100%,其中中等-强阳性表达率达83.8%；而11例正常组织中UBE2T表达明显较低,以阴性或弱阳性为主（10/11,90.9%）。统计学分析结果表明UBE2T在恶性肿瘤和正常组织中的差异表达具有统计学意义（P<O.001）。2、肝癌中UBE2T表达水平的分析qRT-PCR检测了在30对原发性肝癌组织及其癌旁组织中UBE2T mRNA的表达水平,采用配对t检验的方法比较肝癌及其癌旁组织UBE2T mRNA的表达水平有无差异；Western blot检测26例原发性肝癌及其癌旁组织中UBE2T蛋白水平的表达。结果表明肝癌组织中UBE2T表达高于肝癌癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.001）。免疫组织化学检测133例肝癌石蜡标本中UBE2T的表达,结果发现,与癌旁组织相比,UBE2T在肝癌组织中明显高表达。应用Spearman秩相关分析UBE2T的表达与原发性肝癌临床病理参数之间的关系,其表达与肝癌肿瘤数目（P=0.001）、BCLC分期（P<0.001）、门脉癌栓（P=0.002）、远处转移（P=0.033）等密切相关,与性别、年龄、病理分级、肿瘤大小、复发等无明显相关性。Kaplan-Meier分析UBE2T与原发性肝癌预后的关系,分析结果表明UBE2T与肝癌患者总体预后相关（P=0.001）,无论肝癌患者有无复发,UBE2T的表达都与肝癌患者预后相关,与肝癌患者无病生存率无明显相关（P=0.738）。采用COX比例风险回归模型对各临床病理参数、UBE2T表达与原发性肝癌预后的关系进行单因素与多因素分析,分析结果表明UBE2T （HR=1.933、P=0.004）、肿瘤复发（HR=1.911、P=0.005）均为原发性肝癌患者发病的独立预后因素,ALB（HR=0.605、P=0.035）为肝癌患者发病的独立保护因素。我们根据这三个肝癌的独立预后因素,将肝癌患者分为低危险组与高危险组（低危险组患者包括UBE2T高表达、无复发、ALB≥40g/L,或UBE2T低表达、有复发、ALB≥40g/L,或UBE2T低表达、无复发、ALB≤40g/L;高危险组患者包括UBE2T高表达、有复发、ALB≥40g/L,或UBE2T低表达、有复发、ALB≤40g/L,或UBE2T高表达、无复发、ALB≤40g/L）,经过Kaplan-Meier分析发现高危险组与肝癌差的预后明显相关（P<0.001）。3、UBE2T在肝癌细胞中的生物学作用及影响肝癌侵袭转移的机制Transwell检测发现,UBE2T干扰后肝癌侵袭转移能力明显下降；UBE2T过表达之后,肝癌侵袭转移能力明显增强。Western blot检测发现UBE2T干扰后上皮标志物E-cadherin显著上调,间质标志物Vimentin显著下调,UBE2T过表达之后结果相反。结论1、UBE2T在恶性消化道肿瘤组织中的表达普遍增高,可作为诊断消化道恶性肿瘤的一个有价值的分子标志物。2、UBE2T在肝癌中高表达,与肝癌预后密切相关,可以作为肝癌独立的预后风险因素。3、UBE2T可以通过诱导肝癌EMT促进肝癌侵袭转移。
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