草坪型黑麦草高效遗传转化体系的建立及耐逆基因工程

论文摘要

本研究目的在于建立草坪型黑麦草的高效遗传转化体系,培育耐逆的新型黑麦草。首先,优化多年生黑麦草商业品种的再生体系,主要从生长素2,4-D和细胞分裂素BAP的组合,提高培养基渗透势,添加有机物肌醇、有效增加胚性愈伤生长量和保持长时间的胚性能力等角度展开。结果表明,从成熟胚诱导胚性愈伤组织过程中,采用MS+3mg/L 2,4-D+0.1mg/L BAP+0.5g/L肌醇+0.5g/L水解酪蛋白+2g/LGelrite+30g/L蔗糖为基本培养基,对于诱导愈伤组织、抑制成熟胚提前萌发是最适合的培养条件;通过对胚性愈伤在MS+3mg/L 2,4-D+0.1mg/LBAP+2.5g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+3g/LGelrite+30g/L蔗糖的培养基上继代改造,使胚性愈伤富集,并作为遗传转化的起始材料;相对以液体培养方式增加胚性愈伤生长量而言,固体培养基上连续继代的方式,使遗传转化程序上更简便,且减少白化苗频率。为获得耐逆的新型黑麦草,我们采用基因枪法和农杆菌LBA4404介导方式,向多年生黑麦草中导入一个来源于拟南芥HS基因家族中的成员——HS1基因。对转基因植株进行分子鉴定和除草剂Basta抗性实验,结果表明有六株转基因再生苗,其中五株是通过农杆菌介导转化后获得的。六个转基因株系中以T5在表型上与非转基因植株比较差异比较明显,T5分蘖粗壮、分蘖性强,根部发达,根系粗且长。对部分转基因植株做抗旱处理,从处理后的表型上看,T2和T3有一定的耐旱能力,T2好于T3;T1和非转基因植株比较没有明显差异。200mMNacl处理T2、T3和T5转基因植株,三个转基因株系都能耐受盐胁迫,在盐胁迫条件下根系生长良好,其中以T5差异最为显著。分析转基因植株在干旱和盐胁迫下的脯氨酸含量、MDA累积、SOD和CAT的酶活,结果表明,耐旱的转基因株系相对于非转基因植株,有较低水平的脯氨酸和MDA累积,较高水平的SOD和CAT酶活;非转基因植株中有较高水平的脯氨酸和MDA,较低水平的SOD和CAT酶活,并且酶活趋势上呈急剧的单峰曲线,而T2、T3和T5中都酶活力持续时间长,在一定时期内能稳定的清除胁迫后的自由基和过氧化氢。因此,我们认为来源于拟南芥的HS1基因在黑麦草中同样具备抗旱耐盐的生理功能,是一个适合用做抗旱耐盐遗传改良的重要基因。

论文目录

• 目录
• ABBREVIATION
• 第一部分 草坪型黑麦草高效遗传转化体系的建立及耐逆基因工程
• 摘要
• ABSTRACT
• 综述一、禾本科草的基因工程研究进展
• 参考文献
• 综述二、植物中的抗旱耐盐基因工程研究
• 参考文献
• 研究一、黑麦草离体再生体系的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 种子活力
• 2.2 不同接种方式对草坪型黑麦草Impulse愈伤组织形成频率和愈伤状态的影响
• 2.3 草坪型黑麦草品种间愈伤组织诱导频率和状态比较
• 2.4 培养基中不同添加物对黑麦草愈伤质量的影响
• 2.5 胚性愈伤的分化
• 2.6 液体培养方式对黑麦草再生能力的影响
• 3 讨论
• 研究二、黑麦草中转拟南芥耐盐抗旱基因HS1的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 愈伤组织生长阶段PPT抗性浓度确定
• 2.2 黑麦草种子萌发期对PPT的抗性
• 2.3 基因枪转化后的GUS基因瞬时表达检测
• 2.4 基因枪介导耐盐抗旱基因HS1在黑麦草中的转化
• 2.5 农杆菌介导耐盐抗旱基因在黑麦草中的转化
• 2.6 转基因植株的鉴定
• 2.7 转基因黑麦草的表型特征
• 2.8 转基因黑麦草在干旱和盐处理条件下的表型特征和生理生化分析
• 3 讨论
• 第二部分 拟南芥热激启动子hsp70b的调控特点
• 摘要
• ABSTRACT
• 综述 热诱导调控元件表达模式的研究
• 参考文献
• 研究内容 热诱导启动子hsp 70b的克隆和其缺失启动子区在表达载体中的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 hsp70b启动子的克隆和序列分析
• 2.2 hsp70b启动子的克隆和系列缺失载体的验证
• 2.3 在洋葱表皮细胞上hsp70b启动子启动GUS的表达
• 2.4 RT-PCR分析不同启动子区在BY2细胞中的转录活性
• 2.5 不同条件下hsp70b启动子系列构建物在烟草中的表达分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录A（载体）
• 附录B（MS）
• 附录C（PNS营养液成分）
• 致谢