论文摘要
肺癌已经成为当今世界恶性肿瘤死亡的最主要原因。几十年来不仅在中国世界各地恶性肿瘤死亡率的主要原因均为肺癌,而且在中国其发病率仍在不断攀升。不幸的是,大多数肺癌患者直到疾病已经发展到晚期才被诊断出来。鳞状细胞癌（Squamous-cell carcinoma, SCC）、腺癌、小细胞癌、大细胞癌是最常见的四个肺癌的组织学亚型。女性肺癌三个主要类型（鳞状细胞癌,腺癌和小细胞癌）的发病率都增加了,尤其快速增加的腺癌已经成为当今女性肺癌的主要类型。而在男性中,鳞状细胞癌成为占主要地位的肺癌类型。这可能是由于改变了吸烟习惯或烟草相关产品（如低焦油含量香烟和使用过滤器或吸入器吸烟）。近年来在许多国家中,肺腺癌在男性当中的发病率已经远超过鳞状细胞癌,成为主要的肺癌类型。由于女性对腺癌易感性的不断增加,需要更多的研究来阐明相关的分子机制,并最终找到最理想的治疗方法。流行病学调查显示,大蒜（大蒜属植物）的消费与许多癌症死亡率成反比关系。主要的流行病学调查显示食用大蒜可以显著降低消化道恶性肿瘤的死亡率,在中国最明显的就是胃癌死亡率。一系列大蒜衍生化合物（也称为有机硫化合物）（Organsulfer compounds, OSC）,包括水溶性硫化合物如S-烯丙半胱氨酸（S-allylcysteine, SAC）和S-烯丙基巯基半胱胺酸（S-allylmercaptocysteine, SMAC）和脂溶性硫化合物,即烯丙基硫醚（Diallyl sulfide, DAS）,二烯丙基二硫化物（Diallyl disulfide, DADS）,二烯丙基三硫化物（Diallyl trisulfide, DATS）和阿焦烯,已被丰富的、已经发表的实验室证据证明有预防肺癌的生物学作用。二烯丙基三硫化物（DATS）是大蒜衍生化合物（也被称为有机硫化合物OSC）。DATS可以诱导许多种癌细胞系的细胞凋亡并抑制其生长。尽管,是否因为分子中不同数量的硫原子造成了不同个体硫化丙烯的生物化学及毒理学的不同这一观点还未被充分的证明,但是DATS,因其结构中含有硫烷硫,相比较SAC、SMAC、DADS、DADS而言,具有更强的生物活性和更大的毒性。越来越多的证据表明,DATS显示了潜在的对肝细胞癌和结肠癌、前列腺癌等细胞的增殖抑制和诱导凋亡的能力。它已经被证明在人类肺癌细胞株H358和H460中能够通过增加亲凋亡蛋白和减少抗凋亡蛋白的产生而诱导凋亡的发生,但并没有改变Bax和Bak蛋白的表达。然而上述情况在正常的人类支气管上皮细胞系BEAS-2B中却并非如此。然而,DATS如何能够抑制肺癌细胞系的增殖并诱导其凋亡但正常细胞却仍能够存活的具体途径仍不得而知,甚至偶尔还会出现使用相同的细胞株却得出完全相互矛盾的结果的情况。除此之外,关于DATS在体外和体内的系统研究数据仍相对少见。以上所有这些相关研究中,只有一个是关于DATS和硒在中国自然村庄人口中对胃癌的化学防癌作用的干预试验。由于样本中女性的数量较少,需要更多的相关研究。相对于癌细胞而言,对非肿瘤细胞的低毒性是任何一个化学防癌试剂所必备的先决条件。我们的研究旨在试图通过明确DATS诱导肺癌细胞凋亡的同时避免非肿瘤细胞的凋亡的分子机制从而验证DATS是一个理想的化学防癌剂。本实验第一部分的研究旨在探讨,DATS诱导的细胞凋亡是否通过降低抗凋亡因子bcl-2,导致Bax/Bcl-2比例和半胱天冬酶3、8的活性的上调,是否产生线粒体依赖的、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（半胱天冬酶）的级联反应。DATS诱导的细胞凋亡和增殖抑制是否呈现出扩散浓度和时间依赖性。不仅如此,通过建立移植了A549肺癌细胞的雌性BALB/c裸小鼠动物模型,我们希望能够明确喂饲DATS的裸小鼠相对对照组而言,其A549肺癌细胞移植物是否能出现显著的生长阻滞并且不引起体重减轻或任何其他副作用。希望通过本实验第一部分的研究能够进一步探讨DATS是否可以作为理想的抗癌药物。他汀类药物,作为羟甲基戊二酸辅酶A （Hydroxymethylglutaryl coenzyme A, HMG-CoA）还原酶抑制剂,是一类能够有效降低血浆胆固醇水平的药物。他汀类药物在降低心血管疾病的发病率与死亡率方面有着无可争议的地位,并且已经被广泛应用于心源性疾病的一线和二线预防用药。除了降低血脂的功效外,他汀类药物在体内与体外模型中还表现出抗癌特性。他汀类药物介导的蛋白酶体活性与细胞周期阻滞及细胞凋亡有着密切的关系。近年来已有报道证实,他汀类药物在体外能够改变丙氨酸氨基转移酶的信号传导并在降低细胞增值率方面发挥一定作用。除此之外,还有报道指出,他汀类药物能够增加一系列肿瘤细胞对传统化疗药物的敏感性。实际上,他汀类药物已经被发现在一系列肿瘤细胞诸如结直肠癌细胞、前列腺癌细胞中表现出抗癌特性。但是,迄今为止,应用他汀类药物对抗肿瘤进展仍存在着争议。一些报道显示,他汀类药物并没有降低实验模型中癌症的发生率,但在同一细胞系中有时能出现完全相矛盾的结论。据我们所知,关于肺癌与他汀类药物的相关研究检测罕见报道。更主要的是,他汀类药物抗癌特性的分子生物学机制仍不清楚。所以,需要更多关于他汀类药物如何在肺癌中发挥抗癌和化学防癌作用的研究。本研究的第二部分中,我们假设他汀类药物治疗可能通过抑制细胞增殖、影响细胞周期、下调细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖激酶（Cyclin-dependent kinase, CDKs）的蛋白表达、诱导细胞凋亡和降低基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase-9, MMP-9）水平来达到抑制肺癌进展的作用。应用人肺癌细胞系A549细胞和最具代表性的他汀类药物-辛伐他汀的体外实验被设计出以检测我们这一假设。希望通过本实验第二部分的研究能够进一步探讨辛伐他汀是否可以作为理想的抗癌及化学防癌药物。一、大蒜素对肺癌A549细胞凋亡及增殖抑制的体外与体内研究目的通观察DATS诱导肺癌A549细胞凋亡时抗凋亡因子bcl-2及Bax/Bcl-2比例和半胱天冬酶3、8的活性的变化,产生的线粒体依赖的、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（半胱天冬酶）的级联反应的情况；通过建立移植了A549肺癌细胞的雌性BALB/c裸小鼠动物模型,比较喂饲DATS的裸小鼠相对对照组而言,其A549肺癌细胞移植物出现了显著的生长阻滞并且不引起体重减轻或任何其他副作用的情况。从而验证DATS是一个理想的化学防癌剂。方法1.细胞培养：在含10%FBS、1%的青霉素-链霉素的RPMI1640中,37℃、5%二氧化碳、95%空气加湿条件下,细胞培养孵化器内培养人类肺癌细胞株（A549）。2.MTT检测：用MTT法测定A549所受DATS的细胞毒性。将细胞种于96孔板（5×105细胞／毫升）,用三个浓度（25μm,50μm,100μm） DATS分别刺激1小时。然后更换新的RPMI1640培养基培养48小时。所有细胞进行MTT检测。每组取5孔并计算平均值。3.RNA的提取及半胱天冬酶3、8的实时定量PCR：所有组细胞均用TRIzol Kit试剂提取总RNA。进行半胱天冬酶3、8的实时定量PCR。引物序列如下：GAPDH:forward,5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’ reverse,5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’;caspase-3:forward,5’-TGCATACTCCACAGCACCTGGTTA-3’ reverse,5’-C ATGGCACAAAGCGACTGGATGAA-3’;caspase-8:forward,5’-TTTCACTGTGTTAGCCAGGGTGGTA-3’ reverse,5’-CCTGTAATCCCAGC ACTTTGGGAG-3’。 GAPDH作为内参使用,并且所有实验均重复5次。4.半胱天冬酶3、8的活性检测：应用比色测定试剂盒测定细胞中半胱天冬酶3、8的活性。使用的细胞为单独培养及使用100μm DATS刺激后72小时的A549细胞。所有检测均重复3次。5.蛋白印迹分析：单独或与DATS一起培养的A549细胞中的所有蛋白提取出后,加样到12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。然后电泳转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1小时后,与包括bcl-2、Bax的一抗孵育过夜。与含有荧光二抗的辣根过氧化物酶孵育后TBST洗涤三次,用化学发光法检测目的蛋白。6.动物实验：四十个雌性BALB/c裸小鼠（6周龄）购自中国科学院动物研究所。整个实验过程中,饲养于无特定病原体及食物和水随意取用的条件下。动物协议依据山东大学动物伦理委员会的相关规则。A549细胞被用来建立肿瘤模型的裸鼠。主要为,准备A549的单一细胞悬液。老鼠皮下注射悬于100μl PBS中的A549细胞悬液（5×106/只）,同时,小鼠随机分为两组。一组口饲溶于100μl PBS中的6μm DATS隔日一次（DATS组,n=20）；另一组口饲100μl PBS（对照组,n=20）。观察动物一般情况。30天处死后检测肿瘤的发生率及肿瘤体积。7.所有数据以平均值±标准差显示。通过单向方差分析和t检验建立统计学意义。使用统计分析软件SPSS13.0.P<0.05被认为是有统计学差异。结果1. DATS在体外抑制A549细胞的存活：通过MTT法检测DATS作用后的肿瘤细胞存活率,我们发现A549细胞与DATS孵育后其活性被明显抑制。不仅如此,这种对肿瘤细胞的抑制作用呈现出剂量依赖性。2. DATS在体外升高半胱天冬酶3、8的表达：半胱天冬酶3、8的mRNA表达量在DATS作用组较对照组显著升高。同时,我们检测了半胱天冬酶3、8的体外活性。在使用100μm DATS刺激48小时后,半胱天冬酶3、8的活性较对照组有显著的提高。3. DATS在体外诱导Bcl-2的表达：Bcl-2在肿瘤细胞的凋亡、增殖及侵袭活动中发挥了关键作用。本研究中,我们通过检测Bcl-2蛋白的表达量试图揭示DATS对A549细胞作用的可能机制。结果显示,DATS的作用导致了A549细胞中Bcl-2蛋白表达的显著下调。本实验中,我们分别建立了不同的浓度及时间梯度。我们发现100μmDATS较其它两组能够取得更大的作用,从而进一步说明DATS对A549细胞的作用呈剂量依赖性。较对照组和24小时组而言,Bcl-2蛋白表达在48小时组的下降尤为显著。但是,Bcl-2蛋白表达在72小时组并没有进一步下降。4. DATS在体内抑制肺癌细胞的生长：我们通过建立的BALB/c裸鼠模型来检测DATS的抗肿瘤作用。通过摄入DATS,实验组裸鼠较对照组裸鼠而言,肿瘤的发生率及肿瘤的体积均能够显著下降。结论我们的研究表明,DATS诱导的细胞凋亡是通过显著降低抗凋亡因子bcl-2,从而导致Bax/Bcl-2比例和半胱天冬酶3、8的活性的上调,产生的线粒体依赖的、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（半胱天冬酶）的级联反应。DATS诱导的细胞凋亡和增殖抑制呈现出扩散浓度和时间依赖性。不仅如此,通过建立移植了A549肺癌细胞的雌性BALB/c裸小鼠动物模型,我们发现喂饲DATS的裸小鼠相对对照组而言,其A549肺癌细胞移植物出现了显著的生长阻滞并且不引起体重减轻或任何其他副作用。以上所有的体外和体内实验证据均表明DATS可以作为理想的抗癌药物。二、辛伐他汀对肺癌A549细胞凋亡及增殖抑制的研究目的肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。近些年来,已有文献报道他汀类药物具有抗癌及化学防癌的特性。但是辛伐他汀在肺癌细胞中的作用机制仍不明确。本部分研究旨在进一步明确辛伐他汀对肺癌A549细胞凋亡及增殖抑制的作用机制。方法1.细胞培养：在含10%FBS、1%的青霉素-链霉素的RPMI1640中,37℃、5%二氧化碳、95%空气加湿条件下,细胞培养孵化器内培养人类肺癌细胞株（A549）。2.MTT检测：MTT法测定A549细胞在辛伐他汀作用下的存活率。将细胞种于96孔板（5×105细胞/孔,200μl）过夜。分为对照组与刺激组,刺激组用三个浓度（1μm, l0μm,50μm）辛伐他汀分别刺激48小时。孵育后将MTT液加入到每个孔当中检测A549细胞所受细胞毒性。每组取5孔并计算平均值。3.细胞周期分析：对照组细胞每孔单独孵育,辛伐他汀组细胞用50μm辛伐他汀孵育48小时。按照细胞周期检测试剂盒说明书常规操作。4.RNA的提取及实时定量PCR：所有组细胞均用TRIzol Kit试剂提取总RNA。进行半胱天冬酶3、8、9及Xiap的实时定量PCR。引物序列如下：GAPDH:forward,5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’ reverse5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’;caspase-3:forward,5’-.TGCATACTCCACAGCACCTGGTTA-3’ reverse,5’-C ATGGC ACAAAGCGACTGG ATGAA-3’;caspase-8:forward,5’-TTTCACTGTGTTAGCCAGGGTGGTA-3’ reverse,5’-CCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAG-3’;caspase-9:forward,5’-GCTTCGTTTCTGCGAACTAACA-3’reverse,5’-GTTGGCTTCGACAACTTTGCT-3’;Xiap:forward,5’-CACTTGAGGTTCTGGTTGCAG-3’ reverse,5’-TGCAAAGCTTCTCCTCTTGC-3’。 GAPDH作为内参使用,并且所有实验均重复5次。5.蛋白印迹分析：单独或与辛伐他汀一起培养的A549细胞中的所有蛋白提取出后,BCA法检测蛋白浓度,加样到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。然后电泳转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2小时后,与包括鼠bcl-2、兔Bax、兔细胞周期蛋白D1、兔CDK4、兔caspase-3、兔caspase-8、兔caspase-9、兔Xiap蛋白、兔MMP-9、兔NF-κB以及兔β-actin的一抗孵育过夜。与含有荧光二抗的辣根过氧化物酶室温孵育2小时后,用TBST洗涤三次,用化学发光法检测目的蛋白。6.所有数据以平均值±标准差显示。通过单向方差分析和t检验对照组与刺激组之间的统计学差异。使用统计分析软件SPSS13.0. P<0.05被认为是有统计学意义的差异。结果1.辛伐他汀抑制A549细胞的存活：通过MTT法检测辛伐他汀作用后的A549细胞存活率,我们发现A549细胞与不同浓度（1μm,10μm,50μm）辛伐他汀孵育48小时后,较对照组而言,10μm和50μm能够显著抑制细胞存活,1μm组能轻度抑制A549细胞,但结果没有统计学差异。辛伐他汀对A549细胞的抑制作用呈现出剂量依赖性。2.辛伐他汀导致A549细胞Bcl-2的下调和Bax的上调表达：Bcl-2和Bax家族在肿瘤细胞的凋亡、增殖及侵袭活动中发挥了关键作用。本部分研究中,我们通过蛋白印迹法检测了Bcl-2和Bax的蛋白表达量。值得注意的是,为了评价A549细胞时间及浓度反应性,我们用不同浓度的辛伐他汀刺激了不同时间。就时间反应性,48小时组取得最显著的效果。另外,50μm组相对其它浓度组能够显著减低Bcl-2并升高Bax的蛋白表达。结果显示,辛伐他汀对A549细胞的作用呈时间和剂量依赖性。所以50μm刺激48小时被用作进一步的实验。3.辛伐他汀对细胞周期的作用：我们通过检测肿瘤细胞细胞周期阻滞情况来揭示他汀类对生长抑制的机制。相比对照组而言,加入辛伐他汀后G1期细胞的比例显著增高。这些数据说明,辛伐他汀将细胞周期阻滞于G1期,这或许是其抗肿瘤作用的机制之一。另外,我们检测了细胞周期关卡蛋白,细胞周期蛋白D1和CDK4,它们存在分布改变。我们发现细胞周期蛋白D1和CDK4的表达在辛伐他汀刺激48小时候显著下降,并且呈剂量依赖。4.辛伐他汀诱导A549细胞凋亡：通过几项检测来确定辛伐他汀是否引起A549细胞凋亡。细胞加入50u m辛伐他汀48小时后,通过检测半胱天冬酶3、8和9的mRNA及蛋白表达来评估半胱天冬酶在辛伐他汀介导的细胞凋亡中的作用。值得注意的是,A549细胞中半胱天冬酶3、8和9的mRNA及蛋白表达在辛伐他汀刺激组中较对照组显著上升。这些结果显示,辛伐他汀激活了A549细胞中半胱天冬酶的级联反应,从而在细胞凋亡中发挥了重要作用。Xiap在调节肿瘤细胞凋亡中发挥了重要的作用。本部分实验中,我们检测了Xiap在A549细胞中的mRNA和蛋白表达,并且发现辛伐他汀能显著下调Xiap的mRNA和蛋白表达。结果显示辛伐他汀能够诱导A549细胞凋亡。5.辛伐他汀抑制A549细胞中MMP-9的表达及NF-κB的激活：通过蛋白印迹法检测MMP-9的蛋白表达,我们发现辛伐他汀降低MMP-9蛋白表达呈现出剂量依赖性。P65是NF-κB的主要组成部分,我们检测了NF-κB的P56水平。经过50μm辛伐他汀孵育48小时后,辛伐他汀组中NF-κB的P56水平显著下降。结果显示辛伐他汀抑制A549细胞中MMP-9的表达及NF-κB的激活。结论他汀类药物有助于肺癌的治疗并且有可能成为肺癌理想的抗癌或化学防癌剂。
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