德国奥德河水中生物膜形态及其生物多样性的研究

论文摘要

河流自净是污染河流进行自我修复的重要能力。生物膜是河流中相对稳定存在的微生物群落结构,在河流自净过程中发挥着重要的作用。对河流生物膜的形成过程及其生物多样性的探讨,对于理解河流自净过程及河流内污染物质的转移具有重要的意义。本研究以德国奥德河流域的生物膜为研究对象,从微生物学角度尤其是采用分子生物学手段来研究河流生物膜的群落结构,采用扫描电镜与元素分析探测器联用、CARD-FISH、DGGE等分子生物学手段对生物膜的形态及组成及生物膜的群落结构及动态变化进行研究,并对奥德河流域的生物膜上的铁锰氧化细菌进行了分离,确定了铁锰氧化细菌的系统进化地位及其特征。对奥德河生物膜的元素组成分析确定,生物膜主要的金属元素为铁和锰,铁锰氧化物为无定形。生物膜在形成初期即24h内,以铁锰氧化细菌附着为主,铁锰氧化细菌在载体上形成具有特异的胞外聚合物结构的大小为1mm的微菌落。而对成熟生物膜的超微结构研究表明,生物膜内存在着具有特异EPS“洞穴”结构的杆菌,并存在着其他的能够形成EPS的鞘细菌、浮霉菌属、生芽细菌,且大多具有附着功能。对奥德河生物膜上铁锰氧化细菌的系统进化地位分析得知:Oder河铁锰氧化细菌全部属于Beta-菌纲,分布于五个进化分支内,五个进化分支的代表菌属为Comamonadaceae bacterium MWH55、Leptothrix dischophora、Leptothrix mobilis、Ideonella sp.及Spherotilus natant。部分铁锰氧化细菌在R2A液体培养基中表现出明显的自絮凝特征,形成1.5 cm自凝集颗粒。BIOLOG对部分菌种不同碳源利用能力的测定表明:分离菌种对糖类、梭酸类和氨基酸类培养基三大碳源的利用强度较大。不同菌种的铁锰氧化细菌在铁二号培养基中形成不同形态的铁锰氧化物菌体结构。采用CARD-FISH对奥德河流域生物膜细菌群落组成、动态变化及空间分布研究表明,Beta-变形菌纲是两个取样点生物膜的主要组成菌群。随着膜龄的增长,Anglerteich与Mummert生物膜上真细菌的比例也相应增加。Anglerteich与Mummert取样点相比,7天膜龄的生物膜中alpha-、beta-、gamma-变形菌纲细菌比例均高于Mummert取样点的生物膜;而在15天膜龄的生物膜中,除gamma-变形菌纲细菌比例有所增加,alpha-及beta-变形菌纲细菌比例均低于Mummert取样点的生物膜。对Oder河流域膜龄为24h、7d、15d的生物膜细菌群落的空间分布研究表面:膜龄24h的生物膜细菌群落仅与beta探针杂交发出信号,当膜龄7d时,Anglerteich生物膜上的真细菌以长链鞘细菌为主,而Mummert 7d膜龄的生物膜上的真细菌形态更为多样,细菌之间的相互关系更为复杂。存在于Anglerteich生物膜上alpha变形细菌的形态及细菌间的关系明显复杂于Mummert生物膜,并发现了生丝微菌属或柄杆菌属黏附寄生于鞘细菌的结构。Beta-探针主要是与Anglerteich及Mummert 7d膜龄生物膜上的鞘细菌进行杂交。Anglerteich 7d生物膜上能与Gamma-探针杂交发出信号的细菌主要为长丝状菌体,而Mummert 7d生物膜能与Gamma-探针杂交发出信号的细菌则为球状及短杆状菌体。Anglerteich 15d生物膜上真细菌的分布为螺旋菌、杆菌及鞘细菌共存。而Mummert 15d生物膜上的真细菌分布演替为杆状细菌成为主体优势菌。存在于Anglerteich 15d生物膜上的beta-亚纲细菌很少,而Mummert 15d生物膜中存在着大量的能够与beta-探针杂交的细菌,并发现Leptothrix discophora典型的弯曲结构。对DGGE检测Oder河生物膜群落多样性的优化过程表明,适合Oder河流域生物膜基因组DNA提取的方法为Fast DNA? SPIN Kit for Soil。确定了16S rRNA的PCR扩增最佳引物为P2/P3。通过DGGE图谱得知两个取样点中存在同一优势菌种,并随着季节的变化而进行着量的变化,但季节和水环境也都影响了群落的构成

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 课题来源
• 1.1.2 课题研究的背景和意义
• 1.2 淡水环境的生物膜
• 1.2.1 淡水环境生物膜的定义
• 1.2.2 淡水环境生物膜的组成
• 1.2.3 淡水环境生物膜的形态和结构
• 1.2.4 淡水环境生物膜的种群构成及分布特征
• 1.2.5 淡水环境生物膜结构的研究方法
• 1.2.6 生物膜的形成原因及影响因素
• 1.3 河流生物膜的研究现状
• 1.4 铁锰氧化细菌的研究现状
• 1.4.1 铁锰氧化细菌氧化铁锰的机理
• 1.4.2 铁锰氧化细菌的分类
• 1.4.3 铁锰氧化细菌的分离纯化
• 1.5 主要研究内容
• 第2章 试验材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 取样方法
• 2.2.1 取样点的确定
• 2.2.2 取样方式
• 2.3 生物膜的细菌分离培养及鉴定
• 2.3.1 分离方法
• 2.3.2 分离用培养基
• 2.3.3 平板全菌落种属的确定
• 2.4 生物膜形态结构观察
• 2.4.1 光学显微镜观察
• 2.4.2 扫描电镜显微镜表面形态观察
• 2.4.3 元素组成分析
• 2.5 生物膜群落动态组成和多样性分析
• 2.5.1 荧光原位杂交（FISH）
• 2.5.2 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 2.6 生物膜上的铁锰氧化细菌的分离与鉴定
• 2.6.1 铁锰氧化细菌分离培养基的确定
• 2.6.2 铁锰氧化细菌的测续
• 2.6.3 BIOLOG微平板技术检测铁锰氧化细菌对碳源的利用
• 2.7 河流水质分析
• 第3章 Oder河流域生物膜的形态及特征
• 3.1 Oder河流域生物膜的环境条件
• 3.1.1 Anglerteich取样点
• 3.1.2 Mummert取样点
• 3.1.3 Oder河取样点
• 3.2 Oder河流域生物膜元素组成分析
• 3.2.1 碳载体生物膜元素组成分析
• 3.2.2 硅载体生物膜元素组成分析
• 3.3 Oder河流域生物膜的形态与结构
• 3.3.1 Oder河流域生物膜的显微结构
• 3.3.2 Mummert 及Oder生物膜的超微结构
• 3.4 本章小结
• 第4章 Oder河铁锰氧化细菌的系统进化地位及特征
• 4.1 铁-锰氧化细菌的分离
• 4.1.1 铁锰氧化细菌分离培养基的确定
• 4.1.2 铁锰氧化细菌分离方法的确定
• 4.1.3 铁锰氧化细菌纯培养物的获得
• 4.2 铁锰氧化细菌的生理生化特征
• A₀01 的生理生化特征'>4.2.1 OTSz_A001 的生理生化特征
• A₀02 的生理生化特征'>4.2.2 OTSz_A002 的生理生化特征
• A₀03 的生理生化特征'>4.2.3 OTSz_A003 的生理生化特征
• A₀06 的生理生化特征'>4.2.4 OTSz_A006 的生理生化特征
• M₀01 的生理生化特征'>4.2.5 OTSz_M001 的生理生化特征
• M₀03 的生理生化特征'>4.2.6 OTSz_M003 的生理生化特征
• M₀06 的生理生化特征'>4.2.7 OTSz_M006 的生理生化特征
• 4.3 Oder河铁锰氧化细菌 16S rDNA测序方法的优化
• 4.3.1 单菌落-PCR直接测序法
• 4.3.2 单菌落-DNA提取-PCR直接测序法
• 4.3.3 多菌落-DNA提取-PCR直接测序法
• 4.4 Oder河铁锰氧化细菌的系统进化地位
• 4.5 本章小结
• 第5章 Oder河流域生物膜微生物群落结构及组成
• 5.1 CARD-FISH检测Oder河生物膜群落组成实验条件优化
• 5.1.1 Leptothrix spp.寡核苷酸探针应用于CARD-FISH条件的优化
• 5.1.2 α，β，γ变形菌纲探针应用于CARD-FISH反应条件的优化
• 5.2 Oder河流域生物膜细菌群落组成、动态变化及空间分布
• 5.2.1 Oder河流域生物膜细菌群落组成及动态变化
• 5.2.2 Oder河流域生物膜细菌群落的空间分布
• 5.3 DGGE检测Oder河生物膜群落多样性实验条件优化
• 5.3.1 生物膜DNA最佳提取方法的确定
• 5.3.2 16S rRNA的PCR扩增最佳引物的确定
• 5.4 Oder河生物膜群落PCR-DGGE指纹图谱的分析
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 个人简历