论文摘要
肺癌是主要威胁人类生命的肿瘤之一,特别是我国城市空气污染严重的现状以及烟民数量的快速增加,肺癌的发病率呈上升趋势。专家预测,到2025年我国每年死于肺癌人数将超过100万,而肺癌总治愈率仍仅15%左右,术后5年生存率为30%-50%。目前临床上,肺癌的治疗是以外科手术为主,并结合化疗和放疗的综合治疗。但对于手术不能切除的肿瘤,特别是对转移复发的中晚期肿瘤,只能采取化疗、放疗等辅助治疗,由于其副作用较大而在临床应用中受到诸多限制。因此,国内外学者越来越多地将注意力转向肿瘤的导向治疗上。因为肿瘤的导向治疗可以达到特异地杀伤癌细胞,并尽可能降低对正常细胞的毒副作用。如果将放射性核素偶联具有导向性的特异性抗体,一方面通过抗体介导与肿瘤抗原特异结合,同时利用放射性核素所发出的射线,加强对癌细胞的作用,提高抗肿瘤的疗效。10余年来,肿瘤的导向治疗已作为一种重要的治疗模式被广泛研究和应用于临床。免疫显像和免疫治疗是生物治疗的重要组成部分,对肿瘤及其转移的诊断、精确分期和治疗方案的确定均有重要意义。导向研究成功关键与否在于抗体的选择和制备。自1975年Kohler和Milstein成功地制备第一株单克隆抗体以来,单抗的研究经历了鼠源性抗体人源化改造、小分子抗体和抗体展示文库三个研究阶段。其中抗体文库的出现使基因工程抗体技术进入了一个新的发展阶段。针对鼠源性单克隆抗体在人体应用时易发生的异源性问题和导向治疗中大分子抗体存在的穿透力较差的问题,我们尝试用噬菌体抗体库技术构建肺腺癌相关的人源单链抗体文库,并对文库进行初步筛选,制备肺腺癌人源单链抗体,标以放射性核素后,在荷人肺腺癌裸鼠模型中进行放免显像。目的:利用噬菌体抗体库技术制备肺腺癌人源单链抗体,标以放射性核素,进行放免显像研究,为肺癌的放免导向治疗奠定基础,为肺癌患者提供一种可行的有效的辅助治疗手段。方法与结果:第一部分噬菌体抗体文库的构建1.人源单链抗体基因文库的构建:取肺腺癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源,提取淋巴结的总RNA。设计简并引物,用RT-PCR的方法分别扩增抗体重链和轻链可变区基因cDNA文库。首先分别用网格筛选确定扩增VH和VL基因片断的引物对,以cDNA为模板扩增VH和VL基因片断,再以VH和VL基因片断为模板分别扩增VH-linker和VL-linker,然后用SOE-PCR技术将它们拼接后引入酶切位点Sfi I和Not I,胶回收PCR产物即得到scFv基因片断。结果显示:肺腺癌周围淋巴结总RNA的提取琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带;扩增VH的引物对为HuJH3FOR与HuVH5aBACK;扩增VL的引物对为HuJκ4FOR与HuVκ5aBACK ;扩增VH-linker的引物对为HuJH3Linker与HuVH5aBACK;扩增VL-linker的引物对为HuJκ4FOR与Linker-HuVκ5aBACK;引入酶切位点的引物为HuVH5aBACKSfi与HuJκ4FORNot。VH基因的大小为370bp,VL基因的大小为350bp,组装后的scFv基因约为750bp。2.单链抗体基因文库与噬菌体载体pCANTAB-5E的拼接:制备转化效率达到108cfu/μg pUC18 DNA的高浓度电转菌TG1。单链抗体PCR产物经Sfi I和Not I双酶切后,胶纯化回收。酶切产物与噬菌体载体pCANTAB-5E连接反应后,电转化大肠杆菌TG1,结果获得2.2×107cfu/μg氨苄青霉素抗性克隆。随机进行酶切反应鉴定,阳性插入率为83.3%（20/24）。酶切阳性质粒测序结果证实抗体重链和轻链以整码的单链抗体方式准确插入了载体。3.噬菌体抗体的展示:用2-YT培养液收集上述获得的阳性插入克隆.进行M13K07辅助噬菌体的感染,在无糖环境下诱导单链抗体片段的噬菌体展示。重组噬菌体的滴度达到1012cfu/ml。第二部分噬菌体抗体库的初步筛选1.肺腺癌细胞株对抗体库的富集:先以人成纤维细胞筛选后再用肺腺癌细胞A549对噬菌体抗体库进行了5轮富集,对抗体库富集前后滴度测定结果表明噬菌体滴度逐渐升高。第一轮噬菌体收获率为1.59×10-6,第五轮噬菌体收获率为2.88×10-4,第五轮噬菌体收获率是第一轮的181倍。2.表达可溶性scFv抗体:强阳性重组噬菌体克隆感染E.coliHB2151,经1mmol·L-1IPTG诱导表达可溶性scFv抗体。3.亲和柱层析纯化可溶性抗体:将上述可溶性抗体过HitrapTM Anti-E Tag柱进行亲和柱层析,先用中性缓冲洗去未结合抗体,再用酸性缓冲洗脱结合的目的抗体,并用碱性缓冲中和,用A280检测,合并峰值高的溶液,进行蛋白定量。4.用细胞ELISA测定可溶性抗体的免疫活性:肺腺癌A549的A405nm为0.71±0.05,乳腺癌细胞MDA-MB-435的A405nm为0.25±0.08,结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与肺腺癌细胞A549结合,而不与乳腺癌细胞MDA-MB-435结合。其中有6个噬菌体scFv与A549细胞反应的P/N值大于MDA-MB-435的两倍以上。第三部分人源单链抗体的放射性核素标记及鉴定用氯胺T法对肺腺癌细胞A549筛选后的可溶表达的单链抗体scFv进行131I标记,Sephadex G200柱层析进行纯化,测定标记率、比活度、放射化学纯度。分别测定131I-scFv在室温和与新鲜人血清37℃孵育后放射化学纯度的变化,了解其稳定性。结果显示:scFv的131I标记率为81.2±5.3%,比活度为3.1±0.2MBq/μg。Sephadex G200分离纯化得到的第一放射峰即为131I-scFv,经24h室温稳定性分析,其放射化学纯度略有降低,但均大于90%。与新鲜人血清37℃孵育分析其稳定性,测得放射化学纯度48h比1h略有降低,但均大于90%。第四部分131I-scFv在荷瘤裸鼠体内的分布及SPECT（单光子发射型计算机断层）显像131I-scFv在荷人肺腺癌裸鼠模型的体内分布及在荷人肺腺癌裸鼠的SPECT显像研究显示:1.荷人肺腺癌裸鼠模型的体内分布:在荷人肺腺癌裸鼠模型的体内,131I-scFv的放射性瘤/血、瘤/肌肉比值逐渐升高,在3d达峰值（瘤/血、瘤/肌肉比值分别为4.06±0.13、5.17±0.97）。2.荷人肺腺癌裸鼠的SPECT显像:在肿瘤部位有放射性浓聚,可见到较清晰的肿瘤影像。结论:本研究利用噬菌体抗体库技术制备的肺腺癌人源单链抗体,标以放射性核素,进行放免显像,结果表明通过噬菌体抗体库技术可以直接从肺腺癌病人癌周淋巴结中获得相关的完全人源的单链抗体,以放射性核素131I标记,其标记率较高、放射化学纯度高、比活度符合要求,且稳定性好、靶向性较强,得到了较满意的放免显像的效果,使肿瘤的放免导向治疗成为可能。