棉铃虫中肠Cry1A结合蛋白分离、鉴定及其与抗性的关系

论文摘要

转基因棉花的大规模种植对控制棉花害虫的危害发挥了重要作用,但害虫长期处于转基因作物Bt毒蛋白的高压选择下,害虫对Bt作物抗性问题将不容忽视。昆虫对Bt毒素的抗性机制是复杂和多样的,但中肠结合位点的改变是最主要的一种机制。棉铃虫中已知的受体有氨肽酶N和钙粘蛋白。保存在本实验室的高抗Cry1A蛋白的棉铃虫品系经前人研究未发现该品系存在钙粘蛋白基因的缺失、失活,比较抗、感品系棉铃虫的钙粘蛋白、APN序列,只发现少量氨基酸的变异,因此该棉铃虫品系对Cry1A产生抗性很可能与受体蛋白表达水平变化相关或存在其它的受体蛋白。本文首先比较了两种双向电泳系统以及几种BBMV提取方法对双向电泳的影响,建立了棉铃虫中肠Bt结合蛋白蛋白质组学的研究方法,利用蛋白质组学的方法分离和分析了棉铃虫中肠Cry1A毒素的结合蛋白,比较了抗、感品系棉铃虫中Cry1Ac结合蛋白的变化,探讨该棉铃虫品系对Bt毒蛋白产生抗性的可能机制。并比较了抗、感品系棉铃虫中与不同Bt毒蛋白作用的结合蛋白的差异。在国内首次开展了利用蛋白质组学研究棉铃虫的中肠Bt结合蛋白及其与抗性的关系。主要结果如下:1、方法的建立:比较ISO-DALT和IPG-DALT两种双向电泳系统,发现这两种系统都可以用于棉铃虫Cry1Ac结合蛋白的分离,ISO-DALT对结合蛋白的分离效果虽比IPG-DALT更好,尤其对高分子量蛋白的分离明显优于IPG-DALT法,但由于上样量少,因此对后续的质谱分析非常不利;IPG-DALT虽较昂贵但有利于进行后续试验,因此本文选用IPG-DALT系统进行双向电泳。比较已报道的这三种BBMV提取方法:Wolfersberger法、English-Readdy法、Abdul-Rauf法,结果显示这三种方法对分离Cry1Ac结合蛋白的种类没有影响,但这三种方法获得的蛋白量不一样结果。总结三种方法的优点,建立了一种新的综合BBMV提取方法,获得了高量的蛋白,通过双向电泳和结合试验证明该方法适合双向电泳Cry1A结合蛋白研究。2、利用双向电泳结合Western杂交以及生物质谱的方法,研究了棉铃虫中肠Cry1Ac结合蛋白,首次鉴定得到棉铃虫中肠四种新的Cry1Ac结合蛋白:V-ATPase亚基B、热激蛋白、肌动蛋白以及一种未知的新蛋白。肌动蛋白和V-ATPase亚基A已报道为烟芽夜蛾中Cry1Ac结合蛋白,热激蛋白和未知新蛋白为首次报道的昆虫中肠Cry1Ac结合蛋白。3、用蛋白质组学的方法比较了抗、感棉铃虫中肠结合蛋白的数量和表达量,结果发现结合蛋白种类无差异,但其中一种新的结合蛋白在抗性品系中表达量至少下降了6.49倍。前人的研究说明,碘标记结合试验证明结合位点或受体数目减少是该抗性品系对Cry1A毒蛋白产生抗性的主要原因。结合前人研究和本文结果,本文新结合蛋白表达量严重降低可能是该抗性品系产生抗性的原因之一。4、初步比较Cry1Ac、Cry1Ab和Cry1Ah作用于敏感品系和抗性品系的结合蛋白。结果发现无论是抗性品系和敏感品系Cry1Ab的结合都是最少的,在敏感品系中,Cry1Ab未结合肌动蛋白和V-ATPase,而Cry1Ac和Cry1Ah对肌动蛋白和V-ATPase结合强,说明新蛋白和热激蛋白对毒素的作用过程来说可能是必需的,肌动蛋白和V-ATPase可能与毒力相关。前人研究Cry1Ab和Cry1Ah对Cry1Ac毒蛋白抗性品系存在一定的交互抗性,各个Bt蛋白在Cry1Ac抗性品系和敏感品系中结合蛋白的差异还是存在于新蛋白的表达量上,新蛋白表达量下降可能与交互抗性产生有关,也可能存在其他的原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 棉铃虫及昆虫对Bt 抗性现状
• 1.1.1 昆虫对Bt 杀虫剂田间抗性
• 1.1.2 昆虫对Bt 室内抗性
• 1.1.3 昆虫对Bt 作物田间抗性
• 1.2 Bt 毒蛋白及其作用机制
• 1.2.1 Bt 简介
• 1.2.2 Bt 毒蛋白作用机制
• 1.3 昆虫对Bt 毒蛋白的抗性机制
• 1.3.1 中肠蛋白酶的改变
• 1.3.2 中肠结合位点的改变
• 1.3.3 其他抗性机制
• 1.4 昆虫中肠受体的种类
• 1.4.1 氨肽酶N （APN）
• 1.4.2 钙粘蛋白（Cadherin-like）
• 1.4.3 碱性磷酸酯酶（ALP）
• 1.4.4 糖酯（Glycolipid）
• 1.4.5 其他
• 1.5 目前Bt 作物害虫抗性治理策略
• 1.6 蛋白质组学的研究进展及其在昆虫中的应用
• 1.6.1 蛋白质组学技术的发展
• 1.6.2 蛋白质组学在模式昆虫中的应用
• 1.6.3 蛋白质组学在非模式昆虫中的应用
• 1.6.4 展望
• 1.7 本文研究目的和意义
• 1.8 研究内容及技术路线
• 第二章 ISO-DALT 和IPG-DALT 两种双向电泳系统比较及BBMV 提取方法比较
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 供试药剂及器材
• 2.1.3 部分试剂及缓冲液的配制
• 2.1.4 BBMV 的提取
• 2.1.5 Cry1Ac 毒素及抗体
• 2.1.6 蛋白含量测定
• 2.1.7 双向电泳
• 2.1.8 银染
• 2.1.9 Western 杂交
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 Cry1Ac 原毒素及活化
• 2.2.2 各种BBMV 提取方法对蛋白浓度的影响
• 2.2.3 两种双向电泳系统对BBMV 蛋白分离的影响
• 2.2.4 ISO-DALT 重复性分析（等电聚焦仪为Mini-PROTEAN Tube Cell）
• 2.2.5 各种BBMV 提取方法对Cry1Ac 结合蛋白分离的影响（SDS-PAGE）
• 2.2.6 各种BBMV 提取方法对Cry1Ac 结合蛋白分离的影响（ISO-DALT）
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 棉铃虫中肠Cry1Ac 结合蛋白的分离和鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 供试药剂及器材
• 3.1.3 部分试剂及缓冲液的配制
• 3.1.4 BBMV 的提取
• 3.1.5 蛋白含量测定
• 3.1.6 双向电泳
• 3.1.7 凝胶图像匹配和分析
• 3.1.8 蛋白胶内酶解和质谱鉴定
• 3.1.9 质谱数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 BBMV 蛋白的分离
• 3.2.2 Cry1Ac 结合蛋白的检测
• 3.2.3 质谱鉴定Cry1Ac 结合蛋白
• 3.2.4 钙粘蛋白的鉴定
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 抗、感棉铃虫中肠Cry1Ac 结合蛋白比较
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试昆虫
• 4.1.2 供试药剂及器材
• 4.1.3 部分试剂及缓冲液的配制
• 4.1.4 BBMV 的提取
• 4.1.5 蛋白含量测定
• 4.1.6 双向电泳
• 4.1.7 凝胶图像获取和分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 抗、感棉铃虫BBMV 蛋白的分离比较
• 4.2.2 抗、感棉铃虫中肠Cry1Ac 结合蛋白比较分析
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 抗、感棉铃虫中肠几种Bt 结合蛋白比较
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试昆虫
• 5.1.2 供试药剂及器材
• 5.1.3 部分试剂及缓冲液的配制
• 5.1.4 BBMV 的提取
• 5.1.5 蛋白含量测定
• 5.1.6 双向电泳
• 5.1.7 凝胶图像获取和分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 抗、感棉铃虫Cry1Ac、Cry1Ab 和Cry1Ah 结合蛋白的检测
• 5.2.2 抗、感棉铃虫Cry1Ac、Cry1Ab 和Cry1Ah 结合蛋白比较分析
• 5.3 结论与讨论
• 第六章 全文结论
• 6.1 全文主要结论
• 6.2 有待于进一步研究的工作
• 参考文献
• 附录1 蛋白点1-9 MALDI-TOF 质谱图
• 附录2 蛋白点2 ESI MS/MS 质谱图
• 致谢
• 个人简历