论文摘要
叶色突变体是自然界常见的突变类型,以其性状明显,易于区分辨认的特点,很早就被人们关注。水稻白化转绿突变体是一类新的叶色突变体,其性状大多受一对隐性核基因控制。因此,在生产应用上可作为形态标记性状导入不育系,在两系杂交稻育种中形成纯度快速检测和去杂保纯新技术。同时,也是深入开展植物叶绿体的遗传发育,叶绿素的合成和调控途径,核质间信号转导以及光合作用分子机理等基础理论研究的理想材料。1994年本研究组从光温敏不育系W9461S/W6154S的F1花粉培养后代白化苗中,发现1株可以自然转绿的突变体,该植株在28℃以下温度范围内表现为前1-3叶白化,第4叶开始转为正常绿色。研究观察表明,该白化转绿性状经10代选择,仍表现稳定,属于稳定遗传的叶色突变类型。将该性状转入培矮64S,与其回交3代育成近等基因系“白01S”。本研究以自然条件下水稻白化转绿突变体白01S为对象,对该性状的表型特征,叶绿体超微结构,遗传方式等做了较为系统的研究。重点是对白化转绿突变性状进行基因定位,并对目标区域进行生物信息学分析,找到4个可能与突变性状相关的侯选基因,并通过RT-PCR对侯选基因进行表达分析,为该性状基因的克隆以及叶绿体的遗传发育相关机理研究打下基础,并为生产中的应用提供理论依据。主要研究结果如下:1.突变体白01S的表型特征白01S的叶色特征与已报道的白化转绿突变体存在差异。该突变性状表现为出苗时芽鞘白色,第1片真叶边缘白色,中脉和基部呈现浅绿色,第2叶和第3叶的中脉及基部逐步完全白化,第4叶开始转为正常绿色,叶色与正常植株无差异。2.白01S叶色突变性状的遗传特性白01S与三个正常品种配制杂交组合,进行叶色观察和遗传分析,结果表明所有组合F1代叶色均为正常绿色表型,F2代正常绿苗与白化苗分离比例均符合3:1的期望比。上述结果表明突变体白01S的白化转绿性状是由1对隐性核基因控制。3.白01S叶绿体超微结构变化利用透射电镜对白01S处于白化状态及复绿后的叶绿体超微结构进行观察,结果表明2叶期白化状态的白01S细胞中,没有完整的叶绿体结构及类囊体片层,存在大量类似于前质体时期的泡状结构,以及一些嗜锇颗粒。4叶期复绿后,叶绿体发育正常,出现清晰的基粒类囊体,且数量较多,体积较大,几乎占整个细胞80%,与对照培矮64S无差异。4.白01S的叶色突变基因定位通过SSR分子标记结合BSA法对白化复绿性状进行基因定位,选择水稻12条染色体上325对SSR引物,得到亲本及DNA池间多态性引物14对,初步确定与第3染色体标记RM411,RM2346连锁,遗传距离分别是3.40cM,4.56cM。进一步将白01S/桂99的F2、F3、F4中白苗作为定位群体,最终将突变基因定位在SSR标记RM7134和RM6832之间约390kb区间内,并将该基因暂时命名为rgr（t）。5.侯选基因预测利用水稻基因组注释软件,对RM7134和RM6832之间约390kb的目标区域进行分析,此区间包含4个BAC克隆,预测有70个推定基因位点,将候选基因的功能与叶色突变性状相结合进行分析,并综合生理生化知识,初步将1个编码预测叶绿素a/b结合蛋白基因和3个编码预测细胞色素P450基因作为白苗复绿性状的候选基因。6.RT-PCR基因表达分析选择4个预测基因设计引物进行实时定量RT-PCR表达分析,结果表明:预测基因LOC-Os03g39690,在白01S和培矮64S中存在显著表达差异,该基因在培矮64S中的表达量非常高,而在白01S中几乎不表达,经生物信息学分析,该基因编码512个氨基酸的推测细胞色素P450,故推测该基因是叶色调控的重要侯选基因,在叶绿体发育或叶绿素合成中起关键作用。